摘 要： 建立了分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定雪茄烟叶中4种烟草特有亚硝胺。样品经0.1 mol/L乙酸铵溶液提取，分子印迹固相萃取柱净化，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离，以0.2 mmol/L乙酸铵甲醇-乙酸铵溶液作为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾离子源正离子模式，多反应监测模式下进行检测，以同位素内标法定量。4种烟草特有亚硝胺的质量浓度在1～200 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，检出限为1.00～2.25 μg/kg。样品的平均回收率为95.67%～102.33%，测定结果的相对标准偏差1.18%～7.28%（n=6）。该方法灵敏度高、准确度高，适合雪茄烟叶中4种烟草特有亚硝胺的测定。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法； 雪茄烟； 烟草特有亚硝胺； 分子印迹固相萃取

 

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草和卷烟烟气中特有的强烈致癌物质，主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、[4-(N-亚硝基甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮](NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT) 4种类型[1]。这些TSNAs在烟草及其烟气中的含量很低且成分复杂，分析难度很大[2]。对这些物质进行准确的定性定量分析，对于烟叶原料的筛选和烟草制品的安全性评价具有重要意义。目前，TSNAs的检测方法主要包括热能分析器的气相色谱(GC-TEA)法[3-4]、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法等。GC-TEA法存在灵敏度低、分析时间长等缺点，且热能分析器对所有的亚硝胺类化合物均有响应，不能区别鉴定共流组分。近年来，GC-MS/MS法被应用到烟气中TSNAs的分析[5-7]，但是由于TSNAs的挥发性和热稳定性较差，GC-MS/MS法检测TSNAs时存在灵敏度低、稳定性差的缺点。相比之下，LC-MS/MS法适用于难挥发、热不稳定化合物的分离，同时具备较高的选择性，灵敏度显著高于GC-MS/MS法，近年来广泛用于电子烟油[8-10]和卷烟烟气[11-12]中TSNAs的检测分析。WU14]建立了同位素稀释LC-MS/MS法测定卷烟、雪茄烟和无烟烟草中的烟草特有亚硝胺，但在实际检测雪茄烟样品时发现，雪茄烟叶基质对TSNAs产生严重的离子抑制效应，导致方法灵敏度较低。此外，待测物MRM色谱图附近出现很多杂质干扰峰，影响了结果的准确性。由于基质复杂，提取液未经净化就直接上机，批量样品检测时出现液相柱压超限导致检测中断，色谱柱和离子源受到严重污染，因此研究一种高效净化技术尤为重要。

笔者建立了分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定雪茄烟叶中4种烟草特有亚硝胺。采用分子印迹固相萃取柱净化烟草特有亚硝胺提取液，利用分子印迹聚合物的高选择性和识别能力以及其物理化学性质的稳定性，有效的去除了烟草基质干扰，提高了烟草特有亚硝胺检测的灵敏度和准确度。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Waters Acquity UPLC I-Class型，美国沃特世公司。

三重四级杆质谱仪：AB Sciex 5500型，美国爱博才思公司。

高速离心机：Eppendorf 5804型，德国艾本德股份有限公司。

数显型旋涡混合振荡仪：Eofo-945008型，美国Tallboys公司。

超纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司。

超声波提取器：P180H型，德国艾尔玛公司。

电子天平：XSR225DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸铵：均为色谱级，纯度(质量分数)均不小于99%，美国赛默飞世尔科技公司。

SCX和PCX固相萃取柱：100 mg（3 mL），美国安捷伦科技有限公司。

亚硝胺类分子印迹固相萃取柱：50 mg（3 mL)，美国西格玛奥德里奇公司。

NNN、NNK、NAB、NAT及氘代内标NNN-d4、NNK-d4、NAB-d4、NAT-d4标准品：CAS号分别为80508-23-2、64091-91-4、37620-20-5、887407-16-1、1020719-68-9、1020719-69-0、764661-24-7、66148-19-4，纯度(质量分数)均不小于98%，加拿大TRC公司。

雪茄烟叶：品种为云雪1号，产自云南临沧，经晾制、发酵后作为实验样品。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；柱温：25 ℃；进样体积：2 μL；流动相：A相为0.2 mmol/L乙酸铵甲醇溶液，B相为0.2 mmol/L乙酸铵溶液，流量为0.35 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

注：A相为0.2 mmol/L乙酸铵甲醇溶液，B相为0.2 mmol/L乙酸铵溶液。

 

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；气帘气压力：0.137 9 MPa；雾化气压力：0.275 8 MPa；辅助气压力：0.275 8 MPa；离子源温度：550 ℃；喷雾电压：5 500 V，采用多反应监测MRM模式。质谱采集参数见表2。

表2   烟草特有亚硝胺的质谱采集参数

Tab. 2   Mass spectrum parameters of tobacco specific nitrosamines

注：*表示定量离子。

 

1.3 实验步骤

1.3.1 标准溶液的配制

单一标准储备液：精确称取NNN、NNK、NAB、NAT、NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4、NNN-d4标准品各0.01 g 分别至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇配制成100 mg/L的单一标准储备液。

混合工作储备溶液：分别移取NNN、NNK、NAB、NAT单一标准储备液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至标线，配制成质量浓度均为1 mg/L的混合工作储备溶液。

混合内标储备溶液：分别移取NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4、NNN-d4单一标准储备液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至标线，配制成质量浓度均为1 mg/L的混合内标储备溶液。

系列混合标准工作溶液：分别取混合工作储备溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL于10 mL容量瓶中，分别加入0.2 mL混合内标储备溶液，用甲醇定容，4种烟草特有亚硝胺标准工作液质量浓度均分别为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L，标准工作溶液中4种内标质量浓度均为0.02 mg/L。

0.1 mol/L乙酸铵溶液：称取7.708 g乙酸铵于烧杯中，用纯水完全溶解后，转移至1 000 mL容量瓶中，用纯水定容至标线，摇匀。

萃取溶液(含内标)：移取2 mL混合内标溶液于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L乙酸铵溶液定容至标线，配制成含0.02 mg/L混合内标的萃取溶液。

1.3.2 样品制备与提取

将雪茄烟叶于40 ℃下烘干后粉碎，过40目筛（孔径0.35 mm），称1 g粉碎的烟叶样品于50 mL离心管内，加入萃取溶液(含内标)10 mL，振荡混匀后，置于超声波超声萃取40 min，静置5 min，以10 000 r/min离心5 min，上清液待净化。

1.3.3 净化

分别用1 mL甲醇和1 mL去离子水活化TSNAs分子印迹固相萃取柱，液面近干时立即加入1 mL上述提取液，弃去滤液，加入1 mL 10 mmol/L乙酸铵溶液，抽真空10 min，再加入1 mL正己烷，抽真空5 min，弃去滤液；分别用1 mL 10%甲醇-二氯甲烷洗脱2次，收集洗脱液至刻度试管，氮气吹干，最后加入0.1 mol/L乙酸铵溶液溶解并定容至1 mL，过0.22 µm滤膜后上机检测。

1.3.4 定量方法

在1.2仪器工作条件下，将系列混合标准工作溶液分别进样测定，以目标物色谱峰面积与对应的氘代内标峰面积的比值作为纵坐标，目标物的质量浓度与氘代内标质量浓度的比值作横坐标，进行线性回归，绘制标准工作曲线，以内标法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 液相色谱条件的优化

流动相的组成和配比不仅会影响目标物的峰形和保留时间，还会影响到离子化效率。采取常用的甲醇-水作为流动相，优化了流动相组成、初始比例、梯度持续及变化时间，考察了不同流动相梯度洗脱条件下4种TSNAs的分离度及出峰效果。结果表明，流动相梯度对4种TSNAs的分离度和峰形影响较大。经过优化，得到了最佳分离度和尖锐峰形，但NNN分成两个峰。在流动相中加入0.2 mmol/L乙酸铵后，4种TSNAs均能获得较好的峰形，NNN不再分叉，同时目标物与杂质的分离度也有所提高，优化后MRM模式下TSNAs标准溶液及加标样品溶液的总离子流色谱图如图1所示。对于液相色谱未能完全分离的NAT和NAB，采用质谱MRM技术可实现两种目标物的定性定量，雪茄烟叶样品中TSNAs的MRM色谱图如图2所示。

图1   TSNAs标准溶液及加标样品溶液总离子流色谱图

Fig.1   Total ion flow chromatogram of TSNAs standard solution and standard sample solution

 

图2   雪茄烟叶样品中TSNAs的MRM色谱图

Fig. 2   MRM chromatogram of TSNAs in cigar tobacco samples

 

2.2 固相萃取柱的选择

参考文献[13]，考察了SupelMIP TSNA柱和两种常用的SCX、PCX固相萃取柱对雪茄烟叶提取液的净化效果和对4种TSNAs回收率的影响。在烟草样品中加入0.1 mg/kg的4种TSNAs，按照1.3.2样品提取步骤萃取，取上清液至不同的固相萃取柱。SupelMIP TSNA柱的使用方法按照1.3.3净化步骤。对于SCX和PCX柱，优化的使用方法为先向柱内加入3 mL甲醇、3 mL去离子水和3 mL 0.3 mol/L盐酸溶液进行活化，当液体与填料齐平时，继续加入5 mL提取液进行淋洗。淋洗后，加入3 mL 50%(体积分数，下同)甲醇水溶液进行淋洗，丢弃后再用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，最后用甲醇定容至5 mL，并取1 mL经0.22 µm有机相滤膜过滤后进行分析。不同固相萃取柱的回收效果如图3所示。

图3   不同固相萃取柱的回收率

Fig. 3   Recovery of different solid phase extraction columns

从图3中可以看出，SupelMIP TSNA柱对4种特有亚硝胺的净化效果和回收效果最好，杂质干扰最小，检出限最低，回收率为97.1%～100.1%；PCX柱其次，回收率为79.1%～95.6%，但仍然有一定的基质干扰目标物的检测，且NNK受到的基质抑制效应较强，影响其检测灵敏度；SCX柱的回收率为69.2%～82.9%，基质干扰较为明显。

2.3 基质效应

基质效应是采用质谱分析时必须考虑的问题，由于雪茄烟叶基质复杂，基质会干扰目标物的离子化，造成目标化合物的仪器响应信号增强或减弱。当基质效应大于100%时，表现为基质增强；当基质效应小于100%时，表现为基质抑制。基质效应会对方法的检出限、线性关系、准确度和精密度产生严重的影响，一般情况下，基质效应在80%～120%范围内为宜。参考文献[15]评价基质效应强度，通过测定0.01、0.1 μg/mL 2种质量浓度下4种TSNAS在雪茄烟叶样品提取液(未净化)中的平均响应值(B，n=3)，以及在甲醇溶剂中的平均响应值(A，n=3)，计算得出基质效应ME1 (ME=B/A×100%)。结果表明，4种烟草特有亚硝胺的基质效应为13.5%～21.3%，表现出较强的基质抑制效应，其中NAT受到的离子抑制效应最强，其次为NNN、NAB、NAT。进一步考察了采用分子印迹固相萃取柱净化后的基质效应，计算得到ME2，结果表明，4种TSNAs的基质效应为95.3%～98.5%，采用分子印迹固相萃取柱净化可以有效的消除基质干扰，降低基质抑制效应，提高烟草特有亚硝胺定量分析的灵敏度和准确性。

2.4 线性方程与检出限

在1.2仪器工作条件下，对系列混合标准工作溶液进行测定，以目标物峰面积与对应的氘代内标峰面积比(y)与质量浓度比(x)进行线性回归，绘制4种TSNAs的标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。将4种TSNAs标准工作溶液逐级稀释，在1.2仪器工作条件下进行测定，连续测定6次，以3倍信噪比和10倍信噪比对应的被测物质量分数分别作为方法的检出限和定量限。4种TSNAs的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。

表3   4种TSNAs的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 3   Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of 4 kinds of TSNAs

 

由表3可知，4种TSNAs的质量浓度在1～200 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法检出限为1.00～2.25 μg/kg。

2.5 加标回收与精密度试验

在低、中、高3个浓度水平下进行加标回收试验，添加浓度分别为雪茄烟叶样品含量的约0.5倍、1倍和2倍，按1.3实验步骤进行处理，在1.2仪器工作条件下进行检测，每个加标水平平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差。加标回收与精密度试验结果见表4。由表4可知，4种TSNAs的平均回收率为95.67%～102.33%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.18%～7.28%(n=6)，表明该方法的精密度和准确度均满足分析技术要求。

表4   加标回收与精密度试验结果

Tab. 4   Results of spiked recoveries and precision test

 

3. 结语

 

建立了分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法定量分析烟叶中4种烟草特有亚硝胺，采用分子印迹固相萃取柱净化雪茄烟叶中TSNAs提取液，高效地去除了烟叶基质干扰，极大地提高了烟草特有亚硝胺检测的灵敏度和准确度，有效降低了批量样品检测对色谱柱和仪器的污染，降低了仪器维护和维修成本。该方法灵敏度和准确度高，适用于雪茄烟叶中4种TSNAs的测定，为雪茄烟叶安全性研究提供了一种有效的检测手段。

 

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引用本文： 陈伟祥，翟大成，徐万超，等 . 分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定雪茄烟叶中4种烟草特有亚硝胺［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：46. (CHEN Weixiang, ZHAI Dacheng, XU Wanchao, et al. Determination of 4 tobacco specific nitrosamines in cigar tobacco leaves by molecular imprinted solid phase extraction ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 46.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 烟草 亚硝胺