近期，河北医科大学第三医院陈伟团队和中科院深圳先进研究院潘浩波、崔旭团队贵州省人民医院任有亮博士在科爱创办的期刊Bioactive Materials上联合发表文章：针对复杂植入物相关骨感染面临的致病菌难清除、感染性骨破坏修复难度大、抗生素骨水泥药物有效率低以及潜在组织毒性等问题，本研究课题组将硼硅酸盐生物活性玻璃（BSG）负载低剂量硫酸庆大霉素PMMA骨水泥用于植入物相关金葡菌骨感染研究。研究发现：BSG对细菌ATP合成具有明显抑制作用，强化了极低GS剂量的杀菌效率与对金葡菌生物膜清除效用，同步实现了局部骨整合。这不但提升了抗生素有效利用率，还降低了抗生素所致细菌耐药与毒性。

 

骨感染是临床骨科灾难性并发症之一。作为骨髓炎的标准疗法，负载抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥对感染病灶中生物膜包裹的细菌杀伤能力极为有限。此外，高剂量抗生素植入物易造成细菌耐药、全身系统性毒性和组织愈合受损等风险。本研究通过将硼硅酸盐生物活性玻璃（BSG）掺入低剂量硫酸庆大霉素（GS）负载的PMMA骨水泥中，提出了一种协同根除细菌并实现顺序性骨整合的智能策略。结果表明，BSG掺入不仅保持了PMMA骨水泥的临床使用性能，还赋予其离子和碱性微环境营造特性。BSG降解所营造的微环境可破坏细菌细胞壁和膜完整性，并通过抑制细胞膜上电子呼吸链抑制细菌ATP合成，同时削弱细菌抗氧化成分（过氧化物酶体和类胡萝卜素），使胞内活性氧（ROS）水平大幅提升。同时，BSG联合GS自身抗菌机制（与核糖体的30S亚基结合，抑制翻译过程），使细菌ATP合成抑制和氧化应激加强，从而实现了远低于GS临床使用剂量下对骨感染病灶内细菌杀灭和生物膜清除。此外，从PMMA植入物中释放出的GS、生物活性离子以及构建的局部弱碱性微环境，还可协同促进hBMSCs成骨表达，进而实现感染微环境下局部骨整合与成骨再生。因此，本研究通过对PMMA中掺入BSG，提出一种可减少临床抗生素剂量和提升植入物抗菌活性与成骨性能的治疗复杂金葡菌骨感染策略。此策略有望有效解决细菌耐药性、感染性骨缺损的修复难题。

 

图1.（a）硼硅酸盐生物活性玻璃和生物活性抗菌骨水泥的制备。EDS成像图像显示BSG在PMMA内均匀分布。（b）将生物活性抗菌骨水泥植入感染性股骨髓腔实现抗菌与促成骨示意图。（c）生物活性抗菌水泥的抗菌机制。（d）生物活性抗菌骨水泥的成骨效应示意图。

 

一．生物活性抗菌PMMA骨水泥的制备与表征

 

本研究采用熔融法制备了硼硅酸盐生物活性玻璃（BSG），傅里叶变换红外光谱（FT-IR）与X射线衍射（XRD）显示：BSG颗粒为非晶态硼氧和硅氧双重网络结构。在PMMA中掺入BSG后，PMMA固化过程温度略降低。同时，骨水泥可操作时间符合外科植入物丙烯酸树脂骨水泥的国际标准（ISO 5833:2002）（不超过15分钟）。由于BSG降解导致PMMA基材内微孔增加，使掺入BSG的PMMA水泥机械性能轻微下降。值得注意的是，在浸泡过程中，B/G/PMMA组始终显示更高 pH值、离子累积浓度和GS浓度，说明BSG和GS能相互促进各自从生物活性抗菌骨水泥的释放。

 

图 2.（a）BSG颗粒的SEM（白色标尺=5μm；黑色标尺=2μm）。（b）B/G/PMMA骨水泥的断面微观形貌（白色比例尺=50μm；黑色比例尺=20μm）和（c）B/G/PMMA骨水泥表面的EDS（比例尺=100μm）。骨水泥操作时间（d）、抗压强度（e）和四点弯曲强度（f）。骨水泥在PBS浸泡不同时间后抗压强度（g）和四点抗弯强度（h）的变化。骨水泥在PBS浸泡不同时间后，PBS的pH值变化曲线（i），（j）BO3³⁻的累积释放，（k）Ca²⁺的累计释放及（l）硫酸庆大霉素（GS）的累积释放。

 

二．生物活性抗菌PMMA骨水泥体外抗菌性能评价

 

其次，本研究评估了生物活性抗菌骨水泥对金黄色葡萄球菌活性、生物膜形成、形态结果影响。结果表明，BSG的离子与碱性微环境，以及GS的释放，能协同强化骨水泥的细菌杀伤和生物膜清除效应。

 

图3.（a）金黄色葡萄球菌菌落图像和（b）定量分析。（c）使用Alamar Blue试剂（激发波长：560 nm；发射波长：590 nm）检测样品表面培养6小时后检测金黄色葡萄球菌的活性。（d）培养6小时后的金黄色葡萄球菌的活/死染色（比例尺=75μm）和（e）形态（比例尺=2μm）。

 

三．金黄色葡萄球菌与骨水泥共培养后的转录组学分析

 

为明确生物活性抗菌水泥的抑菌机制，本研究进行了转录组测序研究，RNA-Seq结果显示，将生物活性抗菌水泥暴露于细菌环境后，生物活性抗菌水泥可立即部分释放所负载的GS，并逐步营造由BSG降解产生的离子和碱性微环境。细胞外高渗透离子环境首先可破坏细菌壁膜结构完整性，同时碱性微环境随后干扰细胞膜上呼吸链、破坏细菌ATP合成，有效降低细菌损伤耐受性，抑制细菌菌落发育及其生物膜形成。随着细胞壁膜破坏加重，积聚在细胞外的GS大量进入金黄色葡萄球菌胞内，使细菌活性受到严重抑制，进而发挥深层次抗菌作用。

 

图 4. 火山图显示PMMA和B/PMMA组（a）间以及B/PMMA和B/G/PMMA组（B）之间的基因表达差异。（c）差异表达基因的维恩图。（d）通过基因集富集分析（GSEA）分析PMMA和B/PMMA组之间金黄色葡萄球菌的跨膜转运、离子转运、膜组成部分和跨膜转运蛋白活性。（e）使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析比较PMMA和B/PMMA组之间金黄色葡萄球菌的上调基因和（f）下调基因。（g）使用KEGG分析比较B/PMMA和B/g/PMMA组之间金黄色葡萄球菌的上调基因和（h）下调基因。（i-k）蛋白质相互作用（PPI）网络图显示的生物过程间联系。

 

图5.（a）热图分析组间差异基因表达。通过蛋白质浓度测试（b）和邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）测定（c）检测膜通透性。（d）生物膜结晶紫染色和（e）在562 nm下的定量分析。（f）595 nm处的ATP定量分析。（g）通过2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测活性氧（ROS）水平与其定量分析，激发波长：480 nm，发射波长：525 nm，比例尺=50μm。

 

四．hBMSCs与骨水泥共培养后成骨分化体外评价

 

本研究还发现BSG降解释放的离子、碱性微环境及低浓度抗生素刺激也有利于hBMSCs的细胞活化，进而显著促进了hBMSCs在体外存活、增殖和成骨分化，同时促进早期（RUNX2）、中期（ALP）和晚期（OCN）成骨基因表达显著上调，提示本研究所构建生物活性抗菌PMMA骨水泥在完成初步抗菌任务后可以顺序增强骨整合，且在体内无任何生物毒性。

 

图6.（a）共培养1天、3天和5天后hBMSCs的细胞毒性和增殖。（b）在24小时后hBMSCs的活/死（比例尺=200μm）和细胞骨架染色（比例尺=50μm）。（c）共培养模式示意图。（d）hBMSCs的碱性磷酸酶（ALP）染色，比例尺=50μm。（e）培养7天后细胞培养基中ALP定量分析。（f）共培养14天后，hBMSCs的茜素红S（ARS）染色，比例尺=50μm。（g）hBMSCs的ARS染色定量分析。在共培养7天后的（h）碱性磷酸酶（ALP）和（i）runt相关转录因子2（RUNX2）基因表达。（j）在共培养14天后的骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）基因表达。（l）在共培养7天和14天后hBMSCs的RUNX2和OCN蛋白表达。

 

五．骨水泥抗菌活性、骨整合和生物相容性的体内评价

 

为进一步检测所构建生物活性抗菌水泥对植入物相关金葡菌骨感染的治疗效果，本研究通过构建植入物相关金葡菌骨感染模型，并植入不同性质的植入物进行治疗，待感染形成1周和2周后，单纯PMMA组实验动物金葡菌感染性股骨髓腔内可见大量菌落。与负载GS的PMMA水泥相比，掺入BSG的生物活性抗菌水泥治疗组显示出优异抗菌活性。X射线显示，PMMA骨水泥组表现出明显骨感染和骨膜反应，而B/G/PMMA组仅显示出轻微骨膜反应。组织学H&E染色显示，除B/G/PMMA组外，PMMA、G/PMMA和B/PMMA组髓腔内有大量炎性细胞浸润，革兰氏染色进一步证实，PMMA、G/PMMA和B/PMMA组可见大量金黄色葡萄球菌定植于骨细胞腔隙小管网络（OLCN）和髓腔内感染性死骨中。Masson染色证明，B/G/PMMA植入物周围大量胶原蛋白形成。上述综合证明，生物活性抗菌水泥具有优异的抗菌作用，可清除定植在骨小管和死骨中金黄色葡萄球菌。植入后4周和8周，Micro-CT结果显示，B/PMMA和B/G/PMMA植入物周围的新骨形成明显，形成壳结构。G/PMMA骨水泥植入物周围只观察到一定量的松散和无定形骨组织，骨参数分析显示，B/G/PMMA组新生骨量最高。

 

图7.（a）体内实验设计。（b）植入后1周琼脂平板法下菌落形成。（c）琼脂平板法菌落定量分析。（d）使用细菌培养法（OD=600nm）评估植入后1周抗菌效果。（e）植入1周和2周后金黄色葡萄球菌感染的大鼠股骨病变X射线照片。（f）X射线评分直方图。（g）植入2周后的苏木精-伊红（H&E）染色、（H）革兰氏染色和（i）Masson染色。

 

图8. （a）植入8周后大鼠股骨的矢状面和三维重建图像。（b）植入后8周骨参数分析，包括骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）。（c）植入4周后H&E染色、（d）革兰氏染色和（E）Masson染色。比例尺=200μm。

 

总之，本研究将BSG负载于低剂量抗生素PMMA骨水泥，为有效解决植入物相关金黄色葡萄球菌骨感染所面临的致病菌清除以及感染性骨缺损修复提供了一种极具前景的策略。研究发现：BSG的加入不仅维持了PMMA的优良机械特性，还可提升PMMA骨水泥生物活性，使其抗菌性大幅改善。机制上，BSG降解损伤了细菌壁膜完整性，降低抗氧化组分（如类胡萝卜素）活性，并阻碍细菌ATP合成。此外，BSG和低剂量GS还可协同促进hBMSCs体内外活性、粘附、增殖和成骨分化。本研究初步验证掺入了BSG的抗生素PMMA骨水泥对金葡菌骨感染的抗菌潜能及骨诱导特性，此研究成果可为进一步解决临床难治性金葡菌骨感染所面临的病原菌清除和感染性骨缺损修复等问题提供重要参考。

 

原文信息

 

Fan M, Ren Y, Zhu Y, Zhang H, Li S, Liu C, Lv H, Chu L, Hou Z, Zhang Y, Pan H, Cui X, Chen W. Borosilicate bioactive glass synergizing low-dose antibiotic loaded implants to combat bacteria through ATP disruption and oxidative stress to sequentially achieve osseointegration. Bioact Mater. 2024 Oct 18;44:184-204. 

 

doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.10.009. 

 

PMID: 39502840; 

 

PMCID: PMC11535878.

 

 

 

来源：Internet

关键词： 植入物