1. 实验原理

 

考马斯亮蓝染色是一种常用的蛋白质检测方法，其原理基于考马斯亮蓝（如R-250和G-250）与蛋白质分子的结合。

 

当染料与蛋白质结合时，其分子构象发生改变，形成蓝色复合物并富集于蛋白质表面的疏水区域，凝胶中原本透明的蛋白质条带因染料聚集而显现蓝色。

 

这一显色机制主要由染料磺酸基团与蛋白质碱性氨基酸残基（如精氨酸、赖氨酸）之间的静电引力驱动，同时伴随范德华力和疏水相互作用的协同效应。

 

显色强度与靶蛋白中碱性氨基酸的丰度及染料结合效率密切相关。

 

图片来源：https://images.app.goo.gl/iswfooKkfNQNZrK78

考马斯亮蓝分为G-250和R-250两类。

G-250在游离状态下呈红色，最大吸收波长为465 nm；与蛋白质结合后转变为蓝色，复合物的最大吸收峰移至595 nm，且吸光度与蛋白质浓度成正比。由于结合迅速，G-250常用于溶液中的蛋白质定量（如Bradford法）。

R-250与蛋白质结合速度较慢，但可通过甲醇-乙酸溶液去除未结合的染料（脱色步骤），因此更适用于电泳凝胶中蛋白质条带的染色。

 

2. 实验材料

 

耗材：SDS-PAGE凝胶、染色槽

试剂：

考马斯亮蓝R250染色液：称取0.25 g考马斯亮蓝R250，加入45 mL甲醇和10 mL冰醋酸，用超纯水补足至100 mL，充分混匀。

脱色液：取250 mL甲醇与80 mL冰醋酸混合，再用超纯水定容至1000 mL，混合均匀后备用。

ddH2O

设备：摇床、电泳仪

 

3. 实验步骤

 

3.1 电泳

通过SDS-PAGE电泳来分离蛋白质，在这个过程中，要按照蛋白质的大小和其所带电荷的状况，选择浓度适宜的凝胶（小分子用浓度大的，大分子用浓度小的）。

3.2 染色

电泳结束后，将凝胶取出，用水冲洗干净。随后加入考马斯亮蓝染色液完全浸没，并在室温下摇床染色约30 min或更长，转速为50-150r/min，具体时间可依据凝胶厚度和实验条件调整，直至颜色接近染液。

3.3 去染

染色结束后，弃去或回收染色液（一般可重复使用2-3次）。随后进行脱色处理，一般脱色时间为2-3 h，期间需更换脱色液，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带清晰可见。如需背景更低的凝胶，则需用纯水浸泡过夜。

3.4 拍照和分析结果

脱色完毕后应尽快拍照，防止凝胶上蛋白和染料的流失。

如图所示为考马斯亮蓝染色的结果图：按照从左到右的顺序，在电泳实验中依次加入上样量为20 μg和10 μg的Hela细胞裂解液，以及上样量为500 ng、100 ng、50 ng、10 ng的BSA纯化蛋白的考马斯亮蓝染色后的胶图。

BSA纯化蛋白组为阳性对照，可进一步评估蛋白分离效果，因为BSA纯化蛋白的分子量相对明确且单一，在电泳过程中会根据其分子量大小在凝胶中迁移到特定位置。

图片来源于：https://bio.vazyme.com/products_7/28.html

 

4. 注意事项

 

染色时间取决于凝胶厚度和温度。较厚的凝胶或较低温度需延长时间，较薄的凝胶或较高温度则可缩短。一般当凝胶颜色接近染液且难以分辨时，说明染色已完成。适当延长至2～4 h或更久，不会影响最终效果。

 

脱色完成后，可将凝胶浸泡在水中以备拍照或其他后续操作。但长期浸泡可能导致凝胶溶涨，若需避免，可存放于20%甘油溶液中。此外，凝胶也可制备成干胶以便长期保存。

 

在蛋白免疫印迹技术体系中，考马斯亮蓝与丽春红作为互补性染色剂被广泛应用于不同检测阶段，考马斯亮蓝G-250染色液可达成以下三个目的：

 

验证电泳参数有效性（如电流设置、胶体浓度匹配度）；

 

评估转膜完整性（未转出蛋白在凝胶对应分子量位置仍残留可见条带）；

 

纯化蛋白实验时检测目的蛋白是否被纯化出来。

 

与之形成对比的是，丽春红凭借其可逆结合特性，常被用于短暂染色PVDF/NC膜，通过肉眼观察红色条带分布既可快速判断转膜均匀性，又能在BSA封闭液处理前通过脱色缓冲液（TBS-T）完全去除染料，避免干扰后续抗体结合。

来源：实验老司机小米

关键词： 考马斯亮蓝染色实验