摘 要：建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤和海洋沉积物中53种农药和28种抗生素残留。样品分别经酸化乙腈（含0.5%甲酸）和Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液（pH 5.0）提取后，利用PRiME HLB固相萃取柱净化，通过ACQUITY UPLC BEH C18柱分离，在优化的仪器工作条件下测定，用外标法定量。81种化合物的质量浓度在1.0～100.0 μg/L范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法定量限为5.0～10.0 μg/kg。81种化合物的加标平均回收率为66.5%～115.5%，测定结果的相对标准偏差为0.3%～15.2%（n=6）。土霉素等4种化合物的基质效应为55.2%～105.2%，基质增强效应较强，强力霉素等5种化合物为中等基质效应，其他化合物均为弱基质效应。该方法可用于同时测定土壤及沉积物中81种农药和抗生素残留。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；土壤；沉积物；农药；抗生素

 

为了防治农业生产过程中的病、虫、草害，提高农作物的生产效率，农药被广泛使用，对农、林、牧业的生产发展起到了重要的促进作用。我国是农业大国，农药的年生产量和使用量均较大[1‒2]，单位面积农药的施用量也很高，约为世界平均水平的2.5倍[3]。长期大规模地使用农药，以及低效率的使用方式，导致未被利用的农药持续进入环境，并最终在土壤或者水体沉积物中富集。

抗生素是具有抑制或可杀灭其他微生物的一类天然的或者人工合成的化学物质。抗生素不仅可以用于治疗人类疾病，还在畜牧业和养殖业中被大量使用。据2013年统计，我国的抗生素产量接近25万吨，使用量超过16万吨，其中52%作为兽用抗生素和促生长剂使用，其余部分则用于人类疾病的治疗[4]。人和动物摄入的抗生素能够被吸收利用的不足30%，绝大多数则以其代谢产物或者原形通过尿液或者粪便排出体外[5]，进入环境，最后在土壤、水体及沉积物中富集。

在土壤和沉积物中不断富集的农药和抗生素会直接或者间接对人类的健康产生不利的影响[6‒11]。快速、准确地检测土壤及底泥中的农药和抗生素残留水平对科研人员评价其对环境及人类健康的影响有着非常重要的作用。目前常用的测定农药和抗生素残留的方法主要有气相色谱法[12]、气相色谱-串联质谱法[13]、高效液相色谱-串联质谱法[14]等，但由于化合物性质上的差异，很难达到同时检测多种农药残留和抗生素残留的目的[12‒15]。笔者利用通过式固相萃取柱的特点，用两种不同的提取溶剂提取土壤和沉积物中的目标物，分别通过固相萃取柱进行净化，再结合部分农药的性质，使用少量乙腈将小柱中残留的农药彻底洗脱，利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行分析，建立了同时测定土壤和海洋沉积物中三嗪类、有机磷类、拟除虫菊酯类、磺酰脲类、酰胺类等53种农药，和磺胺类、四环素类、大环内酯类、林克霉素类共28种抗生素含量的方法。该方法在提高检测灵敏度的同时，极大地提高了检测效率。

 

1.实验部分

 

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：Acquity I Class-XEVO/TQS型，美国沃特世公司。

电子天平：AX622ZH型，感量为0.001 g，美国奥豪斯公司。

台式冷冻离心机：Sigma 3K15型，德国西格玛公司。

涡旋混匀仪：MS 3 digital型，德国艾卡公司。

20位固相萃取装置：美国安捷伦科技有限公司。

乙腈、甲醇、丙酮：均为色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

甲酸：质谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

柠檬酸(C6H8O7·H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2O8·2H2O)：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

81种农药和抗生素标准物质：纯度(质量分数)均大于98%，天津阿尔塔科技有限公司。

超纯净水生产净水器：membraPure系统，德国曼默博尔公司。

PRiME HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL，美国沃特世公司。

针式过滤器：PTFE-Q型，0.22 μm，13 mm，美国安捷伦科技有限公司。

实验用水为一级水，由membraPure系统制备。

1.2仪器工作条件

1.2.1色谱仪

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)；柱温：30 ℃；流量：0.3 mL/min；进样体积：1 μL；运行时间：12 min；流动相：A相为水(含0.1%甲酸)，B相为乙腈(含0.1%甲酸)；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～1.5 min时A相体积分数为95%，1.5～5.0 min时A相体积分数由95%降至50%，5.0～7.0 min时A相体积分数由50%降至30%，7.0～8.0 min时A相体积分数由30%降至10%，8.0～10.0 min时A相体积分数为10%，10.1～12.0 min时A相体积分数为95%。

1.2.2质谱仪

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；监测方式：多反应监测(MRM)模式；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：0.5 kV；去溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气：氮气，体积分数为99.5%，流量为800 L/h；锥孔气：氮气，体积分数为99.5%，流量为50 L/h；驻留时间：0.163 s；81种化合物质谱参数见表1。

表181种化合物质谱参数

Tab. 1Mass spectrometry parameters of 81 compounds

注：带*号的为定量离子。

 

1.3溶液配制

Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液：向1 000 mL容量

瓶中加入12.9 g C6H8O7·H2O、10.9 g NaHPO4·12H2O和39.2 g C10H14N2Na2O8·2H2O，加入900 mL水溶解，混匀，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至5.0，用水稀释至1 000 mL，混匀。

混合标准溶液：取53种农药(表1中序号1～53)和28种抗生素(表1中序号54～81)各10 mg，分别用有机溶剂溶解并定容至10 mL，得到不同种类农药的标准储备溶液和不同种类抗生素的标准储备溶液；分别取上述53种农药标准储备溶液各0.1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，配制成质量浓度均为1 μg/mL的53种农药混合标准溶液；分别取上述28种抗生素标准储备溶液各0.1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，配制成质量浓度均为1 μg/mL的28种抗生素混合标准溶液。

基质匹配系列混合标准工作溶液：精确吸取一定量的53种农药混合标准溶液和28种抗生素混标标准液，用空白基质溶液逐级稀释成81种化合物的质量浓度均分别为1.0、2.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的基质匹配系列混合标准工作溶液。

1.4样品处理

将土壤样品置于室内阴凉通风处风干，剔除杂物，研磨后全部通过180 μm (80目)筛网，充分混匀。

称取2 g (精确至0.01 g)风干后的土壤或沉积物样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入1 mL水，涡旋振荡30 s后，再加入4 mL乙腈(含0.5%甲酸)，涡旋振荡30 s，冰浴超声10 min，以9 500 r/min转速离心5 min，将上清液全部取出，置于15 mL聚乙烯离心管中备用(上清液1)。

向残渣中加入5 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液，涡旋振荡30 s，冰浴超声10 min，以9 500 r/min转速离心5 min，准确吸取500 μL上清液，通过PRiME HLB固相萃取柱(上样前先后用5 mL甲醇和5 mL水预处理)，弃去流出液，用1 mL水淋洗小柱后抽干。

准确吸取500 μL上清液1，通过上述小柱后，再吸取500 μL乙腈(含0.5%甲酸)洗脱小柱，收集所有通过液，混匀，通过0.22 μm针式过滤器，作为样品溶液。

1.5样品测定

按照1.4方法处理样品后，在1.2仪器工作条件下采集数据，利用外标法进行定量分析。

 

2.结果与讨论

 

2.1提取方法选择

将2 g土壤样品用1 mL水进行水化后，用4 mL含0.5%甲酸的乙腈溶液提取目标物，离心后的上清液直接通过PRiME HLB固相萃取柱净化，结果如图1所示。由图1可以看出，待测农药中除了西玛津和敌百虫的回收率大于70%外，其他大多数农药的回收率均较低，甲氰菊酯、二甲戊灵、对硫磷、毒死蜱、伏杀硫磷、辛硫磷等的回收率均在5%以下，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素4种四环素类抗生素的回收率低于30%，其余抗生素的回收率在47.5%至89.2%之间。分析认为，土壤基质中含有的Cu2+，Fe3+，Mg2+等金属离子可能与四环素类抗生素发生络合反应，加强了这类抗生素在土壤中的吸附行为[16]，从而使这类抗生素很难被乙腈溶液充分提取。

图1用乙腈一次提取时目标化合物的平均回收率（n=3）

Fig. 1Average recoveries with one extraction using acetonitrile （n=3）

为了改善四环素类抗生素的回收率，将提取方法调整为两次提取。第一次提取时，将2 g土壤样品用1 mL水进行水化后，加入4 mL含0.5%甲酸的乙腈溶液进行提取，离心后将上清液转移至干净的试管中。接着用5 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取样品中被络合的四环素类抗生素，离心后，取1 mL上清液通过PRiME HLB固相萃取柱，此时水相上清液中的四环素等目标物可保留于小柱的填料中，然后将第一次提取后的高有机相上清液通过小柱，在净化其中目标物的同时，洗脱小柱上保留的四环素等目标物。两次提取方式大大改善了四环素类抗生素的回收率，结果如图2所示。

图2两种提取方式时四环素类化合物的平均回收率（n=3）

Fig. 2Average recoveries of ontetracyclines compounds using two extraction methods （n=3）

由图2可以看出，经过两次提取后，土霉素、强力霉素、金霉素、四环素的回收率分别为68.8%、70.1%、74.5%、75.8%。值得注意的是，为了避免上机溶液中含有缓冲盐，应先用乙腈提取，再用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液进行二次提取，通过固相萃取柱的顺序则相反，应首先通过第二次提取的缓冲盐上清液，经水淋洗后，再通过第一次提取的乙腈-水上清液。

2.2净化方法选择

两次提取虽然改善了四环素类抗生素的回收率，但是，农药回收率低的问题仍然没有解决。由于大多数农药的辛醇水分配系数较高，如回收率低于5%的农药，包括甲氰菊酯、二甲戊灵、对硫磷、毒死蜱、伏杀硫磷、辛硫磷的辛醇水分配系数分别为6.04、5.4、3.83、4.7、4.01、3.38。同时，虽然磺酰脲类农药在中性条件下的辛醇水分配系数多为负数，但在酸性条件下，其辛醇水分配系数相对较高，比如在中性条件下，甲基二磺隆、嘧苯胺磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆的辛醇水分配系数为-0.48、1.31、-0.59、-1.34，-0.2，而在酸性条件下，这些化合物的辛醇水分配系数分别为1.39、2.02、1.1、0.74、2.5[17‒18]。所建立的方法使用的是酸性提取体系，在这种条件下，磺酰脲类农药更难溶于极性溶剂，这就导致在利用反相萃取材料时，这些辛醇水分配系数较高的农药更易结合在固相萃取柱的填料上，需要洗脱强度更大的洗脱溶剂才能完全洗脱。PRiME HLB固相萃取柱虽然为直接通过型固相萃取柱，但其原理仍然为反相萃取，辛醇水分配系数较大的农药在经过80%乙腈-水提取液洗脱后，绝大部分还保留在萃取填料中，因此在两次提取液分别通过小柱后，增加一次洗脱程序，用含0.5%甲酸的乙腈溶液进行洗脱，测定结果如图3所示。由图3可以看出，所有农药的回收率均在70%和120%之间，表明增加一次洗脱程序，足以将残留在小柱上的农药充分洗脱。在优化的提取和洗脱条件下，81种化合物混合加标样品溶液(20 μg/kg)总离子流图如图4所示。

图3两次提取结合乙腈洗脱后目标化合物的平均回收率（n=3）

Fig. 3Average recoveries of the target compound after two extraction combined with acetonitrile elution （n=3）

图481种化合物加标样品溶液（20 μg/kg）总离子流色谱图

Fig. 4Total ion chromatogram of 81 compound spiked sample solutions （20 μg/kg）

2.3基质效应

以甲醇为溶剂，配制与基质匹配系列混合标准工作溶液相同质量浓度的溶剂系列混合标准工作溶液。按照1.2仪器工作条件，对溶剂系列混合标

准工作溶液和基质匹配系列混合标准工作溶液同时进行测定，并各自进行线性拟合，分析样品的基质效应。基质效应(ME)为基质匹配标准曲线斜率减去溶剂标准曲线斜率后，与溶剂标准曲线斜率的比值乘以100%。当基质效应大于0时，为基质增强效应；当基质效应小于0时，为基质抑制效应。当基质效应在-20%和20%之间时，视为弱基质效应；当基质效应为-50%～-20%或20%～50%时，视为中等基质效应；当基质效应小于-50%或大于50%时，视为强基质效应[19‒20]。81种化合物的基质效应如图5所示。

图581种化合物的基质效应

Fig. 5Matrix effects of 81 compounds

由图5可以看出，土霉素、金霉素、四环素、红霉素为强基质增强效应(ME为55.24%～105.19%)；强力霉素、林可霉素和嘧苯胺磺隆为中等增强效应(ME为25.00%～47.22%)；苯磺隆、五氟磺草胺为中等抑制效应(ME分别为-23.43%和-30.25%)，其他化合物以基质抑制效应为主，并且均呈现为弱基质效应(-20%≤ME≤20%)。由于基质效应的存在，在实际检测过程中，推荐使用空白基质配制基质匹配标准溶液进行定量。

2.4定量限和线性关系

在5.0、10.0 μg/kg加标水平下，每个水平设置6个平行样品，进行加标回收试验，考察方法的定量限。将回收率和测定结果的相对标准偏差均达到可接受水平的最低添加浓度作为方法的定量限。结果显示，当添加水平为5.0 μg/kg时，仅有莠灭净、扑草净、西玛津、三唑磷、二嗪磷5种农药的回收率为83.2%～103.5%，相对标准偏差为5.6%～12.3%，符合方法定量要求，因此将这5种农药的定量限确定为5.0 μg/kg。其他48种农药和28种抗生素在5.0 μg/kg的添加水平下均无法同时满足准确度和精密度的要求。在10.0 μg/kg添加水平下，81种化合物的回收率均为66.5%～115.5%，相对标准偏差均为0.3%～15.2%，因此将其他48种农药和28种抗生素的定量限确定为10.0 μg/kg。

在1.2仪器工作条件下分别测定基质匹配系列混合标准工作溶液，以化合物的定量离子色谱峰面积为纵坐标，以基质匹配标准工作溶液中对应的化合物质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线，进行线性回归分析。结果表明，81种化合物的质量浓度在1.0～100.0 μg/L范围内，各线性回归方程对应的相关系数均大于0.99，说明在此质量浓度范围内，81种化合物均具有良好的线性关系。

2.5加标回收与精密度试验

利用空白土壤样品进行加标回收试验。按1.4方法平行制备6份加标样品溶液，在1.2仪器工作条件下分别进行测定，考察方法的准确度和精密度，结果见表2。由表2可知，样品加标平均回收率为66.5%～115.5%，测定结果的相对标准偏差为0.3%～15.2%，表明该方法的准确度和精密度满足GB/T 27417—2017《合格评定　化学分析方法确认和验证指南》要求。

表2样品加标回收与精密度试验结果(n=6)

Tab. 2Results of samples spiked recovery and precision test (n=6)

 

3.结语

 

建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤和海洋沉积物中53种农药和28种抗生素残留。选择酸化乙腈和Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液两种提取体系对样品进行提取，利用PRiME HLB固相萃取柱净化，用含0.5%甲酸的乙腈溶液进行洗脱。该方法符合定量检测各目标化合物的要求，各化合物的定量限为5.0～10.0 μg/kg，经过基质效应考察，土霉素、金霉素、四环素、红霉素的基质效应为55.2%～105.2%，显示出较强的基质增强效应，强力霉素、林可霉素、嘧苯胺磺隆、苯磺隆和五氟磺草胺为中等基质效应，其他化合物均为弱基质效应，因此在实际检测过程中，推荐使用空白基质配制的标准溶液进行定量。

 

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引用本文：许炳雯 . 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤及沉积物中81种农药和抗生素［J］. 化学分析计量，2025，34（1）： 38.(XU Bingwen. Simultaneous determination of 81 pesticide and antibiotic in soil and sediment by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 38.)

 

 

来源：Internet

关键词： 土壤 农药 抗生素