摘 要：利用液相色谱-质谱法测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-唑酮（AOZ），并对测定结果的不确定度进行评定，分析影响测定结果准确性的因素，从而提高检测结果准确性。按照GB 31656.13—2021《食品安全国家标准　水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定　液相色谱-串联质谱法》测定淡水鲈鱼中的AOZ，建立数学模型，对影响测定结果的不确定度来源如标准物质纯度、溶液配制、样品称量、样品溶液制备、标准曲线拟合、测量复性等因素进行分析和评定。液相色谱-质谱法测定淡水鲈鱼中AOZ的结果为（10.09±1.10） μg/kg，k=2。标准物质纯度、溶液配制、标准曲线拟合以及样品测量重复性是测量不确定度的主要来源，在检测过程中应加以控制。

关键词：液相色谱-质谱法；淡水鲈鱼；3-氨基-2-唑酮；呋喃唑酮代谢物；不确定度

 

呋喃唑酮滥用导致其在淡水鲈鱼鱼体中残留，威胁人体健康[1‒2]。建立准确检测方法评估淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量至关重要。液相色谱-质谱(LC-MS)法作为一种高效、灵敏的分析技术，在危害物残留检测领域得到了广泛应用[3]。该技术以其良好的分离性能、快速的检测速度和高敏感度著称，在检测复合材料中微量药物残留方面表现出优越的适应性[4]。在实际应用中，由于各种因素的影响，LC-MS法的测量结果会存在一定的不确定度[5]，因此，对LC-MS法测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物AOZ的不确定度进行评定具有重要意义[6‒7]。不确定度评定是实验室检测的关键，反映测量结果的可靠性与准确性[8]，可以帮助检测人员分析误差来源，从而减少误差，提高测量结果的准确度[9‒11]。同时，它也是实验室间数据比对和认可的重要依据。

目前国内尚无测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物AOZ的标准方法，为了提高测定结果的准确度，确保相关产品的质量安全，笔者采用LC-MS法测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物AOZ，分析了标准物质纯度、样品称量、溶液配制、样品溶液制备、标准曲线拟合以及样品测量复性等因素对测定结果的影响，全面评定其不确定度[12‒14]。结合文献和试验数据，验证了评定结果的准确性和可靠性[15‒16]。该方法可以为食品安全监管部门提供科学依据，为淡水鲈鱼养殖业的健康发展提供技术支撑[17‒19]。同时，也可为其他危害物残留测定结果的不确定度评定提供参考和借鉴[20]。

 

1.实验部分

 

1.1主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：QTRAP 4500型，美国应用生物系统公司。

数字显示天秤：XS205DU型，感量为0.1 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司

离心机： A-14c型，德国赛多利斯仪器公司。

多管涡旋混匀仪：Multi Reax型，德国海道尔夫公司。

平行浓缩仪：M64型，北京莱伯泰科公司。

超声波清洗器：XM-5200UVF型，昆山市超声仪器公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2-硝基苯甲醛：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

磷酸氢二钾、乙酸乙酯：均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

AOZ标准溶液：100 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批号为2202778，上海安谱科学仪器公司。

AOZ-D4标准溶液：99.6 mg/L，Urel=5.0% (k=2)，批号为S111929，天津阿尔塔科技有限公司。

实验用水为GB/T 6682—2008规定的超纯水。

1.2仪器工作条件

1.2.1液相色谱仪

色谱柱：AtiantisTMT3色谱柱[150 mm×2.1 mm，3 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇-0.1%甲酸溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～1 min时B相体积分数为10%，1～4 min时B相体积分数由10%增加至95%，4～5.5 min时B相体积分数为95%，5.5～6 min时B相体积分数由95%降至10%，6～8 min时B相体积分数保持为10%；流动相流量：0.35 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL。

1.2.2质谱条件

监测模式：ESI正离子多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压：5 500 V；助燃气和喷雾压力：0.448 2 MPa；气体帘幕压力：0.206 9 MPa；辅助加热气温度：550 ℃。AOZ及内标质谱参数见表1。

表1AOZ及内标物质谱参数

Tab. 1Mass spectrometry parameters of AOZ and internal standard

注：带*号的为定量离子。

 

1.3溶液的配制

内标溶液： 0.1 μg/mL，准确量取AOZ-D4标准溶液1.0 mL，置于10 mL A级容量瓶中，以甲醇定容至标线，配制成AOZ-D4的质量浓度为9.96 μg/mL的储备液。再取此储备液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，混匀。

AOZ标准储备液： 0.1 μg/mL，精密量取AOZ标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线，得到AOZ的质量浓度为10 μg/mL的标准中间液。移取0.1 mL标准中间液至10 mL的容量瓶，用甲醇定容至标线，混匀。

AOZ系列标准工作溶液：移取AOZ标准储备液0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL，分别置于6只10 mL棕色容量瓶中，均精确加入50 μL内标溶液，用甲醇稀释后定容至标线，得到AOZ的质量浓度分别为1、2、5、10、20、30 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.4样品处理

称取适量经检验为阳性的淡水鲈鱼样品，用粉碎机粉碎制成肉糜，冷冻密封保存于玻璃容器中。将冷冻的阳性样品于室温下解冻，精密称取2.0 g (精确至0.1 mg)，置于离心管中，精确加入50 μL内标溶液，用旋涡混合器混合1 min。随后加入0.5 mol/L盐酸溶液5 mL和0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 mL，再次旋涡混合1 min。将试管置于恒温振荡仪中，在37 ℃的条件下，避光振荡16 h。

取出离心管，冷却至室温，用0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液调pH值至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋振荡30 s，以6 000 r/min转速离心5 min，取上清液至10 mL玻璃离心管中，在40 ℃下氮气吹干。加入5% (体积分数，下同)甲醇溶液1.0 mL溶解残留物，将溶液转移至1.5 mL离心管中，以14 000 r/min转速离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，滤液即为样品溶液。

1.5测定方法

按照1.2仪器工作条件，分别测定AOZ系列标准工作溶液和样品溶液，以AOZ质量浓度为横坐标，以特征离子色谱峰面积和内标色谱峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线计算样品中AOZ的含量。

 

2.结果与讨论

 

2.1数学模型的建立

根据测量原理，建立数学模型如式(1)和式(2)所示。

 

(1)

 

(2)

式中：A1——样品溶液中AOZ的色谱峰面积；

A2——内标物的色谱峰面积；

B0——标准工作曲线的截距；

B1——标准工作曲线的斜率，mL/ng；

w——样品溶液中AOZ的质量分数，μg/kg；

V——样品溶液稀释总体积，mL；

ρ——样品溶液中AOZ的质量浓度，ng/mL；

m——称取样品的质量，g；

1 000——换算系数。

2.2不确定度来源

由测定过程和数学模型可知， LC-MS法测定淡水鲈鱼中AOZ的不确定度来源主要包括以下6个方面：

(1) 标准物质的相对标准不确定度urel(ρ)；

(2) 溶液配制引入相对标准的不确定度urel(S)；

(3) 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)；

(4) 样品溶液制备引入的相对标准不确定性urel(X)；

(5) 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(L)；

(6) 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)。

2.3不确定度评定

2.3.1标准物质的相对标准不确定度urel(ρ)

根据标准物质证书，AOZ标准溶液的相对扩展不确定度为5%，k=2，则标准物质的相对标准不确定度：

2.3.2溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S)

配制溶液时，用8只10 mL的A级容量瓶，使用0.1 mL移液管2次，使用0.2 mL移液管1次，使用1 mL移液管3次，使用5 mL移液管2次。在整个试验过程中，内标溶液的加入量不影响所配制的溶液浓度，所以配制内标溶液时产生的不确定性不予考虑。容量瓶和移液器体积定值准确性引入的不确定度和定容溶剂因温差(校准温度为20 ℃，实验室温度为25 ℃)产生的体积膨胀引入的不确定度均服从均匀分布，包含因子k=； 5%甲醇溶液中水含量比较高，故其膨胀系数以水计，水的体积膨胀系数为0.001 18 mL/℃。由使用的器皿因定值引入的不确定度及定容溶剂因温差产生的体积膨胀引入的不确定度见表2。

表2溶液配制引入的不确定度

Tab. 2Uncertainty introduced in solution preparation

 

2.3.3样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

连续取样2 g样品共10次，所得平均质量为2.003 g。

采用精度为1 mg的XS205DU型电子天平称量，其检定的最小分度值e等于10倍的观测精度，即10 mg。在试验所涉及的称量范围内，该电子天平显示的最大容许误差限定为其检定分度值的一半，即0.5倍的e值，计算结果为5 mg，即0.005 g。此误差在统计上呈均匀分布，k=，因此天平称量引入的标准不确定度：

g

样品称量引入的相对标准不确定度：

urel(m)＝/＝0.004 56

2.3.4样品溶液制备引入的相对标准不确定度urel(X)

样品溶液制备过程中，使用1 mL移液管移取5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物。由表2可知，1 mL移液管移取1.0 mL 5%甲醇溶液引入的相对标准不确定度：

urel(X)===0.006 73

2.3.5标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(L)

在1.2仪器工作条件下，测定AOZ系列标准工作溶液，结果见表3。以色谱峰面积和质量浓度进行最小二乘法拟合，得到线性方程为y=0.233 01x+0.072 17，相关系数为0.997。残差标准偏差sR按照贝塞尔公式(3)计算，标准曲线拟合引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别按式(4)和式(5)计算。

表3系列标准工作溶液测定结果

Tab. 3Determination results of series standard working solution

 

(3)

 

(4)

 

(5)

式中：sR——标准曲线的残差标准偏差；

n2——系列标准工作溶液的测量次数，n2=6；

Yj——AOZ与内标的色谱峰面积比值；

Aj——第j次测定的AOZ色谱峰面积；

Aj1——第j次测定的内标色谱峰面积；

B0——标准曲线截距；

B1——标准曲线斜率；

j——第j次测量的标准溶液的质量浓度，ng/mL；

n1——样品溶液的测量次数，n1=10；

——样品溶液质量浓度平均值，ng/mL；

——系列标准溶液质量浓度平均值，ng/mL；

u(L)——标准曲线拟合引入的标准不确定度；

urel(L)——标准曲线拟合引入的相对标准不确定度。

将表3数据代入式(4)，计算标准曲线拟合引入的标准不确定度：

=0.582 8 ng/mL

标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：

=0.028 8

2.3.6测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)

对样品溶液平行测定10次，测定结果表4。

表4样品溶液质量分数测定结果

Tab. 4Determination results of mass fraction of sample solution

测量重复性引入的标准不确定度：

u(R)==0.281 7 μg/kg

测量重复性引入的相对标准不确定度：

urel(R)==0.027 9

2.4合成相对标准不确定度和结果表示

各相对标准不确定度分量评定结果见表5。

表5不确定度分量汇总

Tab. 5Summary of uncertainty components

 

上述各不确定度分量彼此独立不相关，则合成相对标准不确定度：

rel(w)

= 0.055

合成标准不确定度：

u(w)=×urel(w)=0.55 μg/kg

2.5扩展不确定度及结果表示

取置信水平为95%，扩展因子k=2，则扩展不确定度：

U=k×u(w)=1.10 μg/kg

LC-MS法测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮代谢物AOZ的结果可表示为(10.09±1.10) μg/kg，k=2。

 

3.结语

 

液相色谱-质谱法测定淡水鲈鱼中呋喃唑酮酮代谢物3-氨基-2-唑酮(AOZ)含量的测量不确定度主要来源于标准物质纯度、溶液配制、标准曲线拟合以及样品测量重复性。在实验过程中通过选用高纯度标准物质，规范并使用高精度的移液器、容量瓶以及天平，提升实验人员的操作水平，增加平行试验的次数，可降低不确定，提高检测结果的可靠性。

 

参考文献：

1HARTZ H E K，KNAUB J K，MAMUN A H M，et al.Using an internal body residue approach to assess acute pesticide toxicity in juvenile Chinook salmon （Oncorhynchus tshawytscha）［J］.Environmental pollution （Barking，Essex：1987），2024，346：123 364.

 

2HENRY L，KISHIMBA M.Pesticide residues in Nile tilapia （Oreochromis niloticus） and Nile perch （Lates niloticus） from Southern Lake Victoria，Tanzania［J］.Environmental Pollution，2005，140（2）：348.

 

3许晓寒思，岑耀颖，朱彤，等.超高效液相色谱-质谱法测定肉类食品中瘦肉精的不确定度评定［J］.化学分析计量，2023，32（4）：83.

XU Xiaohansi，CEN Yaoying，ZHU Tong，et al.Evaluation of uncertainty for the determination of clenbuterol in meat by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Chemical Analysis and Meterage，2023，32（4）：83.

 

4LEITE M，FREITAS A，SILVA S A，et al.Maize （Zea mays L.） and mycotoxins：A review on optimization and validation of analytical methods by liquid chromatography coupled to mass spectrometry［J］.Trends in Food Science & Technology，2020，99：542.

 

5徐玲玲，李怡宁，雷振宇，等.LC-MS/MS法测定桃红四物汤中芍药苷的含量［J］.食品与药品，2024，26（3）：248.

XU Lingling，LI Yining，LEI Zhenyu，et al.Determination of Paeoniflorin in Taohong Siwu Decoction by LC-MS/MS［J］.Food and Drug，2024，26（3）：248.

 

6罗彦平，高海文，岳燕燕，等.黄瓜中乙烯菌核利残留测定的测量不确定度评定［J］.农药学学报，2017，19（4）：500

LUO Yanping，GAO Haiwen，YUE Yanyan，et al.Measurement uncertainty evaluation of vinclozolin residue determination in Cucumis sativus L.［J］.Chinese Journal of Pesticide Science，2017，19（4）：500

 

7赵飞，曹轶男.高效液相色谱法测定葡萄酒中纳他霉素含量的测量不确定度评定［J］.中国检验检测，2019，27（6）：28.

ZHAO Fei，CHAO YiNan.Evaluation of uncertainty for determination of natamycin in wine by high performance liquid chromatography［J］.China Inspection and Testing，2019，27（6）：28

 

8李维玲.不确定度的评定和测量结果的表示［J］.阴山学刊（自然科学版），2006（2）：19.

LI Weiling.Assessment of degree of uncertainty and indication of measuring result［J］.Yinshan Academic Journal（Natural Science Edition），2006，（2）：19.

 

9田甜，文金华，曾祥林.气相色谱-质谱法测定芹菜中甲拌磷残留量的测量不确定度评定［J］.食品安全质量检测学报，2019，10（17）：5 653.

TIAN Tian，WEN Jinhua，ZENG Xianglin.Evaluation of measurement uncertainty for residues determination of phorate in celeryby gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Food Safety and Quality，2019，10（17）：5 653.

 

10何志成.高效液相色谱法测定猪肉中甲氧苄啶含量的测量不确定度评定［J］.福建分析测试，2019，28（6）：56.

HE Zhicheng.Uncertainty evaluation of determination of trimethoprim in pork by high performance liquid chromatography［J］.Fujian Analysis & Testing，2019，28（6）：56.

 

11陈琨，周劭桓，廖艳华.液相色谱-串联质谱法测定鸭肉基质中四环素类的不确定度评定［J］.应用预防医学，2016，22（5）：463.

CHEN Kun，ZHOU Shaoheng，LIAO Yanhua.Uncertainty evaluation of tetracycline in duck meat substrate by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Applied preventive medicine，2016，22（5）：463.

 

12VERSHININ I V，KULESHOVA P M，ISACHENKO A N，et al.Methodology of analysis of unseparated mixtures：error limits in estimating the total analyte concentration recalculated to a standard substance［J］.Journal of analytical chemistry，2013，68（6）：477.

 

13朱剑锋.电子秤称量误差检定及补偿方法［J］.品牌与标准化，2024（3）：207.

ZHU Jianfeng.Calibration and compensation methods for weighing errors in electronic scales［J］.Brand & Standardization，2024（3）：207.

 

14魏玉业，赵凤阳.曲线最佳拟合的评价标准［J］.测绘科学，2010，35（1）：195.

WEI Yuye，ZHAO Fengyang.Evaluation criteria for best curve fitting［J］.Surveying and mapping science，2010，35（1）：195.

 

15高俊峰，陈梦莹，邵瑞，等.液质联用内标法测定饲料中氯霉素残留量的不确定度评估［J］.粮食与饲料工业，2022（2）：64.

GAO Junfeng，CHEN Mengying，SHAO Rui，et al.Evaluation of uncertainty in the determination of chloramphenicol residues in feed by liquid mass spectrometry with internal standard method［J］.Food and feed industry2022，（2）：64.

 

16钟文涛，卢琳，李政，等.基于ISO19036： 2019评估饮用水中大肠菌群的测量不确定度［J/OL］.食品与机械.［2024-07-10］.http：//fffg30fd8c346ef34 d67903a5b6 d8ea5 d318scbpo9650fonc6coc.fgfy.www.gxstd.com/10.13652/j.spjx.1003.5788.2024.80113.

ZHONG Wentao，LU Lin，LI Zheng，et al.Estimation of measurement uncertainty of coliforms in drinking water according to ISO19036： 2019［J/OL］.Food & Machinery.［2024-07-10］.http：//fffg30fd8c346ef34 d67903a5b6 d8ea5 d318scbpo9650fonc6coc.fgfy.www.gxstd.com/10.13652/j.spjx.1003.5788.2024.80113.

 

17赵淑兰.浅谈不确定度的意义［J］.工业计量，1998（3）：12.

ZHAO Shulan.On the significance of uncertainty［J］.Industrial metrology，1998（3）：12.

 

18杜富荣，武振宁.浅述测量不确定度的作用［J］.中国计量，2024（4）：60.

DU Furong，WU Zhenning.The role of measurement uncertainty is briefly described［J］.Chinese measurement，2024（4）：60.

 

19尹文军.日常测量中评估测量不确定度的意义［J］.工业计量，2010，20（S2）：304.

YIN Wenjun.Significance of evaluating measurement uncertainty in routine measurement［J］.Industrial metrology，2010，20（S2）：304.

 

20沈玮，钱梦逸，黄昕润，等.气相色谱法测定黄瓜中腐霉利含量的不确定度评定［J］.分析仪器，2021（5）：90.

SHEN Wei，QIAN Mengyi，HUANG Xinrun，et al.Uncertainty evaluation for determination of humus in cucumber by gas chromatography［J］.Analytical Instrumentation，2021（5）：90.

 

引用本文：黄海霞，廖子祎，王海波，等 . 液相色谱-质谱法测定淡水鲈鱼中3-氨基-2-唑酮的不确定度评定［J］. 化学分析计量，2025，34（1）： 129.(HUANG Haixia, LIAO Ziyi, WANG Haibo, et al. Evaluation of uncertainty for determination of 3-amino-2-oxazolone in freshwater perch by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(1): 129.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 淡水鲈鱼 液相色谱