1. 概述

 

阿利新蓝，也叫爱茜蓝、阿尔新蓝等，英文原名Alcian blue，是一种阳离子染料，对酸性粘液物质具有很强的特异性，是对酸性粘多糖进行染色时最具特异性的染料。染料分子与酸性基团形成盐键，利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性多糖物质的类别。

 

 

在这里介绍这一冷门染色剂是因为，大家在实验室中最常用的电泳技术SDS-PAGE在跑完以后通常都要对蛋白进行染色以可视化。

 

众所周知，蛋白质广泛具有转录后修饰，糖基化是其中一种，而糖蛋白在生物组织中广泛存在，对信号转导具有重要意义。而这一转录后修饰在做WB实验时经常会影响条带的预期位置与分子量等重要信息。

 

常用的蛋白质染色法考马斯亮蓝和银染对糖蛋白检测效果并不好，高度糖基化的糖蛋白由于糖链干扰银离子结合，会导致染色效果弱，灵敏度低，甚至无法检测。这也是各位同学在WB实验中遇到各种玄学的原因之一。

 

虽然有传统的PAS染色法，采用Schiff碱反应检测糖蛋白，其灵敏度也不够高。因此，对具有糖基化修饰的蛋白进行改良的特异性染色很有必要。

 

在此介绍PAS-AB染色法的进一步改良，即过碘酸Schiff-阿利新蓝联用，并辅以银染增强染色效果。

图源：AB-PAS染色-四川赛因斯特生物科技有限公司

 

2. 染色原理

 

使用高碘酸氧化糖蛋白，以避免阿利新蓝单染糖蛋白显色微弱；

 

使用阿利新蓝与氧化的糖蛋白结合以显示糖蛋白；

 

由于阿利新蓝对非糖基化蛋白的银染没有负面影响，使用银染对非糖基化蛋白进行染色，如此操作后，糖基化和非糖基化的蛋白质均被染色。

 

染色优势：

 

可以检测SDS凝胶中纳克浓度的高度糖基化蛋白，适用于浓度很低的混合样品及少量纯样品中的糖蛋白检测。

 

3. 实验材料

 

固定液：10%(v/v)三氯醋酸水溶液

 

洗涤液：Ⅰ，25%(v/v)甲醇，10%(v/v)醋酸；Ⅱ，10%(v/v)甲醇，5%(v/v)醋酸；Ⅲ，5%(v/v)醋酸

 

氧化液：1%(w/v)高碘酸

 

还原液：0.5%(w/v)焦亚硫酸钾

 

染色液：0.125%(w/v)爱茜蓝溶于洗涤液Ⅰ，使用前需过滤

 

光敏处理液：5%(v/v)戊二醛，现用现配

 

显影储液：2.5%(w/v)碳酸钠

 

银液：0.4%(w/v)硝酸银，现用现配

 

显影液：向显影储液中加入甲醛至终浓度为0.013%(v/v)，现用现配

 

终止液：10%(v/v)的醋酸、10%(v/v)甘油

 

4. 染色步骤

 

电泳结束后，将凝胶转移到带盖培养皿中，加入固定液，于30℃固定10 min。

 

用洗涤液Ⅲ洗涤凝胶2次，每次2min。然后将凝胶浸没在氧化液中，于30℃氧化20min，再用洗涤液Ⅲ洗涤凝胶2次，每次2min，再用水洗涤2次，每次2min；加入还原液于30℃还原12min，用水洗涤凝胶2次，每次2min，然后在50℃用洗涤液Ⅰ洗涤凝胶2次，每次2min。

 

加入染色液，于50 ℃染色 15 min。

 

用洗涤液Ⅰ洗涤凝胶3次，时间分别为1、4、5min，然后用洗涤液在59℃洗涤2次，时间分别为2、4min。阿尔新蓝在随后的银染过程中将被不可逆地固定在凝胶中，形成墨绿色的背景，需用稀醋酸冲洗至背景仅保留微弱的蓝色。

 

加入光敏处理液，于50 ℃处理6 min。

 

用洗涤液Ⅱ洗涤凝胶2次，时间分别为3、5min，随后在50 ℃用水洗涤2次，每次2 min。

 

将凝胶浸没在银染色液中，于40℃染色6.5 min。

 

于30℃用水洗涤凝胶2次，每次30s。

 

用新鲜配制的显影液于室温下显影30s，产生黑色的沉淀，将凝胶转移到新鲜的显影液中，再显影4~8min，具体的显影时长需根据所要求的灵敏度和背景染色情况以及特异性调整。通常1~3min后可看到糖蛋白，非糖基化蛋白在4~8 min后显影，按顺序对凝胶进行拍照留档。

 

加入终止液保持5 min，终止显影。

 

5. 参考文献

 

[1] 张建社，褚武英，陈韬，2009，蛋白质分离与纯化技术，军事医学科学出版社

来源：实验老司机

关键词： 电泳 糖蛋白 染色法