本文所涉及的I型胶原软骨修复凝胶类产品，是指所用原材料限定于由动物（牛、猪、鼠、鱼等）的组织（皮肤、肌腱、骨骼等）提取、分离及纯化（交联或非交联）得到的I型胶原蛋白，可采用不同的物理、化学交联方法及其它工艺制备而成的凝胶状支架产品。

根据《医疗器械分类目录》，分类编码为13-10，管理类别为III类。

 

一、I型胶原软骨修复产品的主要风险

开发人需参照GB/T 42062《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》对产品全生命周期实施风险管理，充分识别产品的设计、原材料、制造过程、产品包装、灭菌、运输、贮存、使用等产品生命周期内各个环节的安全特征，从生物学危险（源）、环境危险（源）等方面，对产品进行全面的风险分析，并明确所采取的风险控制措施。动物源性来源产品宜参考YY/T 0771标准、《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》（2017年修订版）开展风险分析。

风险管理内容参考GB/T 42062第9章和《医疗器械安全和性能的基本原则》的2.1.2e)f)。

 

二、I型胶原软骨修复产品性能研究实验要求

1.性能指标

根据产品特性，选择适用的项目进行规定，例如外观（如性状、颜色）、可见异物、装量、胶原蛋白含量、复合成分含量（若适用）、总糖含量、脂肪含量、杂蛋白分析、水分、酸碱度、炽灼残渣、酸水解产物、色氨酸检查（去端肽时）、重金属总量和微量元素、添加剂（包括溶剂）残留、交联剂残留（若适用）、无菌性、环氧乙烷残留（若适用）、细菌内毒素等。建议设定凝胶化相关的性能。

若使用容器包装（如预灌封注射器），并包含配合使用的附件（如注射针），应制定相关适用的性能指标（如预灌封注射器性能指标、注射针性能指标，及推挤力、可注射性能等）。

2.化学/材料表征研究

2.1胶原蛋白材料表征

需明确产品I型胶原的具体来源及其制备工艺。胶原蛋白材料的表征至少需包括如下项目：

2.1.1 I型胶原蛋白分子量

采用电泳法测定胶原蛋白分子量时，按照YY/T 1805.2《组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第2部分I型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法》 进行测试。非变性条件下，胶原蛋白分子量可用分子排阻色谱法检测，具体方法参照《组织工程医疗器械 胶原蛋白》行业标准中的规定进行。

2.1.2 I型胶原蛋白纯度

按照《中华人民共和国药典》“色谱法”的“分子排阻色谱法”测定，按面积归一化法计算纯度。

胶原蛋白具有其他蛋白所没有的三股螺旋结构，可以在特异性的胶原蛋白酶作用下水解形成小分子多肽或者氨基酸；而非胶原蛋白却不会受到胶原蛋白酶的水解作用。因此，可以利用胶原蛋白酶水解样品，结合考马斯亮蓝对牛血清白蛋白染色极限的确定，检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白总量，进而通过相应计算得到胶原蛋白纯度。具体方法参照《组织工程医疗器械 胶原蛋白》行业标准中的规定进行。

2.1.3 肽图

按照《中华人民共和国药典》“肽图检查法”规定的方法进行。

2.1.4其它

随着相关行业标准的更新，需进一步开展胶原蛋白高级结构分析、胶原蛋白自组装性能（非交联产品）、端肽去除程度（若适用）、热稳定性、胶原蛋白-细胞相互作用等研究。

2.2产品组成成分表征

2.2.1 I型胶原蛋白鉴别

红外分光光度法、拉曼光谱法、特征多肽测定法、免疫印迹法、酶联免疫法等可用于胶原蛋白鉴别，宜选择一种或多种方法进行胶原蛋白来源动物种属和/或型别的鉴别。也可选择其他经验证的方法进行胶原蛋白的鉴别。

2.2.2胶原蛋白含量

胶原蛋白含量可用总蛋白含量和纯度计算。总蛋白含量的测定按照YY/T 1511附录A“凯氏定氮法蛋白含量测定”进行，或按照《中华人民共和国药典》“蛋白质含量测定法 第三法 双缩脲法”进行测定。若使用凯氏定氮法，需明确和验证氮转换为胶原蛋白的换算系数。

羟脯氨酸是胶原蛋白中含有的特异性氨基酸，分析测定羟脯氨酸含量后，可以计算出胶原蛋白的含量，可参照YY/T 0954《无源外科植入物I型胶原蛋白植入剂》规定的方法进行。

2.2.3 总糖含量

参照《组织工程医疗器械 胶原蛋白》行业标准中的规定进行。

2.2.4脂肪含量

可参照GB 5009.6《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》的规定进行测定。

2.2.5伴生的其他类型胶原   

与I型胶原伴生的其他型别的胶原对I型胶原自组装有影响，应评估和控制其在终产品中的含量，以确保产品批次间的一致性。其中，III型胶原作为I型胶原主要的伴生胶原，可以采用天狼猩红染色或者更精确的免疫组化、免疫荧光、ELISA等技术对I型和III型胶原进行鉴别与量化。

2.2.6重金属总量和微量元素

其中，重金属总量以铅（Pb）计。取胶原炽灼残渣下遗留的残渣，按照《中华人民共和国药典》0821重金属检查法第二法进行。

微量元素按照《中华人民共和国药典》“原子吸收分光光度法”、“电感耦合等离子体原子发射光谱法”、“电感耦合等离子体质谱法”或相当的方法进行测定。

2.2.7有毒物残留   

I型胶原提取制备过程中，可能存在有毒成分如三氯甲烷、过氧乙酸等残留。参照《中华人民共和国药典》相应检测方法进行测试。

2.2.8酸碱度

酸碱度（pH值）是影响胶原分子发生自组装的关键条件，pH为7.0-7.5 的胶原溶液可以顺利地形成凝胶且成胶时间和成胶效果不会受到明显的影响。按照《中华人民共和国药典》 四部通则0631的pH值测定法，取胶原凝胶前驱体溶液，采用酸度计测定pH值。

2.2.9外源性DNA残留   

按照《中华人民共和国药典》四部3407外源性DNA残留量测定法“荧光染色法”或“定量PCR法”进行。或者参照YY/T 1876《组织工程医疗产品 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》中规定方法测试。

2.2.10 α-Gal抗原残留

α-半乳糖基抗原（简称Gal 抗原）是动物组织、器官移植到人体引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原，广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内，人体由于有2 个碱基错位变异而不表达Gal 抗原，但人血清中存在高滴度的抗-Gal 抗体，因此当人体接受含有Gal 抗原的组织或生物材料时就会引起补体介导的抗体依赖型细胞毒性效应，引起免疫排斥及免疫毒理反应。Gal 抗原缺失小鼠已被广泛应用于异种免疫原性评价。参照YY/T 1561《组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测》中规定方法进行测试。

2.2.11 EO残留

对于经环氧乙烷灭菌后产品的EO残留量的可耐受接触限量，建议参考GB/T 16886.7《医疗器械生物学评价 第7部分：环氧乙烷残留量》中4.3.5.2的要求进行规定。

3.物理和机械性能研究

3.1凝胶化性能和可注射性

凝胶化性能对原位注射赋型的胶原水凝胶非常重要，若适用，可以通过倾斜法、浊度法、光散射法以及动态流变仪等检测手段表征胶原分子聚合动力学、聚合能力、凝胶化时间等。

3.1.1凝胶化性能

宜确定产品的凝胶化时间，可采取已经过方法学验证的测试方法，例如管倾斜试验和动态流变学测试等。凝胶交联度在很大程度上影响着物理性能，实际交联程度与理论交联程度的比值可直接反映交联度，故在适用的情况下，推荐测定产品的交联程度。在某些情况下，可简单地通过计算成胶后浸出物的比例来反映水凝胶交联程度。

3.1.2可注射性

主要考虑宏观可注射性，通过压缩实验检测推动注射器所需力大小，考察不同条件下（储存时间、注射浓度、温度、针头大小等）其可注射性能。鼓励测量剪切粘度变化，进行剪切变稀表征。

3.2水性环境下的形态稳定性

3.2.1溶胀或收缩性能

正常软骨的含水率较高，维持着良好的营养物质透过性能，高的含水率有利于支架材料相关营养物质的渗透运输。建议通过测定材料浸泡前后的质量或者体积变化对材料的溶胀速率、或收缩性能进行表征。

3.2.2保水性

制备好的水凝胶放置在手术的正常条件下，记录温湿度变化，在一段时间内测定凝胶的质量变化，用质量百分数表示。前后质量差与初始质量之比定义为质量变化百分比。                           

3.3力学性能

机械性能或者粘弹性在影响细胞行为与细胞诱导的基质重塑中具有重要作用。根据材料的形态与大小选择，可通过流变仪、动态力学分析仪、纳米压痕仪等对胶原水凝胶力学性能（压缩、剪切等模式）与粘弹性（蠕变、应力松弛、动态力学）进行测试。需注意材料模量等与组织的匹配度及其在体内生物力学微环境影响下的稳定性。

3.3.1弹性模量

可以以动态力学分析仪对样品进行压缩测试，分析其压缩曲线，在低形变线性弹性区计算样品的弹性模量。

3.3.2蠕变和应力松弛

宜在应力松弛表征时，固定材料形变，观察应力随时间的变化趋势；在蠕变行为表征时，固定材料的初始应力，观察形变随时间的变化趋势。

3.3.3抗疲劳性能

对于承重部位的软骨，在人的日常活动中要经历反复的挤压，因此对于胶原水凝胶软骨修复材料的抗疲劳力学性能也提出了相应的要求。可采用针对液体浸没式材料的动态力学分析仪等仪器对水凝胶的抗疲劳性能进行考察，通过压缩加载-卸载循环研究水凝胶的能量耗散，胶原水凝胶样品被压缩到一定应变下循环若干次。建议根据应力应变定义出能量耗散方程，并得出样品的循环压缩强度。

3.3.4 体外组织结合性能

若其他理化性能测试不足以判定产品在软骨缺损部位的固位能力，建议开发人利用体外模型进行产品与组织结合性能的研究，并进行方法学验证。

3.4微观结构

胶原水凝胶的纤维网络结构模拟了细胞外基质的微观结构，影响细胞的粘附、铺展和分化。可将水凝胶样品经液氮处理后冻干，通过扫描电子显微镜观察纤维形态、直径、分布以及多孔结构。拍摄后的图像可采用Image J等图像处理软件对其进行处理和数据收集，而后进行统计计算，但冻干过程引起了凝胶网络结构改变，故仅作为间接评价方法。或者，水凝胶样品直接采用低温扫描电子显微镜或环境扫描电子显微镜对样品的孔结构、纤维形态等进行表征。

3.5传质性能

物质传递性能指细胞、营养、废物物质向基质中或者在基质中扩散的能力，可通过荧光染料-共聚焦显微镜、扩散室、光密度分析等表征。材料需有利于细胞黏附、迁移和增殖；有利于氧气和营养物质传输；有利于代谢物的排出和组织的长入。

为检测胶原水凝胶营养物质的透过性能，可采用氯化钠作为营养物质中离子性物质的代表，色氨酸作为小分子营养物质的代表，测定氯化钠和色氨酸的透过率；同时，可通过共聚焦显微镜观察荧光蛋白分子的扩散来表征水凝胶对蛋白分子的透过率。

4.生物学特性研究

4.1生物相容性评价

生物相容性评价应遵循GB/T 16886.1《医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验》相关要求，生物相容性评价可以参考《医疗器械生物学评价指南》，结合产品的预期接触部位和累积使用的接触时间，必要时开展生物学试验。生物学风险评价终点一般包括细胞毒性、致敏、刺激或皮内反应、材料介导的致热性、急性全身毒性、亚急性毒性、慢性毒性、亚慢性毒性、植入反应、遗传毒性和致癌性。需结合物理和/或化学表征、降解性能等明确产品在上述各项生物学风险评定终点的安全性。

4.2产品与细胞相互作用研究

对产品与软骨修复相关的材料-细胞相互作用性能进行评价，一般可开展产品对细胞的粘附、迁移、增殖、分化等影响的生物学性能评价试验。可参考《组织工程医疗器械产品 软骨支架与细胞相互作用的评价试验》等行业标准的试验方法。

在拟进行体外模拟研究而设定体外试验参数时，宜充分考虑与产品修复再生关节软骨相关的体内因素，如细胞类型、细胞数量、力学刺激等。用作体外研究的产品样品宜具有代表性，需注意样品尺寸（厚度）与申报产品的差异对体外试验结果的影响。体外细胞试验宜选择预期体内发挥修复再生作用的主要细胞类型，细胞接种方式、细胞接种数量要能与植入后初期/早期能长入/迁移入产品的方式和细胞数量相适宜。需要对采用的细胞培养条件提供合理化理由，例如考虑体内软骨修复时的体液环境/软骨的营养方式等，可考虑采用无血清培养基或低百分比含量血清的培养基、低氧培养条件等。体外细胞试验也可考虑施加力学刺激，例如静水压。

4.3生物安全性评价

可参照《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》的要求开展产品免疫原性评价以及病毒灭活评价。

Ⅰ型胶原软骨修复产品的免疫原性的研究、评价与控制主要包括：免疫原性毒理学/临床相关文献数据、免疫毒理学试验、免疫原性风险相关的质量控制以及免疫原性相关不良事件等。应对热原进行控制，致热反应推荐采用家兔法。且应将内毒素水平控制列入出厂检验项目。对于通过提纯去除免疫原性物质的Ⅰ型胶原蛋白，可通过杂蛋白的含量指标进行控制；对于通过脱细胞工艺去除免疫原性物质的Ⅰ型胶原蛋白，应考虑残留细胞数量、残留DNA数量和/或残留α-Gal抗原的数量等指标。开发人宜根据具体产品特性，考虑需增加的性能研究项目，如端肽、损伤相关的分子模式、核酸降解酶以及特异性抗体检测。

在选择免疫学评价项目和设计试验方案时应充分考虑人与实验动物的种属差异。Gal抗原缺失动物可能是评价动物源性生物材料免疫原性的合适模型。如果结合“植入材料特异性抗体检测”，可以同时检测特异性抗Gal抗体之外的材料特异性抗体。

在参考GB/T 16886.20分析选择体外免疫学试验时，要充分考虑样品制备的合理性，比如使用浸提液用于实验样品时要充分分析和证明抗原物质全部被有效浸提出来，客观地分析实验体系的局限性。建议参考最新文献研究，合理选择体外免疫学试验方法，客观评价异种免疫原性风险。

关于病毒灭活，若产品采用常见的工艺，如有机物、射线、强酸等，其过程和方法相对成熟，开发人可采用文献或历史数据对病毒灭活效果进行评价，必要时针对申报产品开展病毒灭活试验验证。鉴于产品主要成分为胶原，宜考虑病毒灭活工艺对胶原性能的影响，以及对产品有效性的影响。

5.体外降解性能

适宜的降解行为对软骨组织修复具有重要作用，需要关注材料的降解性能。

5.1组成成分变化

宜对不同时间点降解产物进行组成成分（如氨基酸和多肽）的分析。

5.2宏观形貌变化

宜采用相机、光学显微镜等对降解不同程度的材料进行宏观形貌的表征。

5.3体积和质量的变化

宜在PBS溶液或胶原蛋白酶溶液环境下，在指定时间点对样品体积和质量进行测定。样品的降解率以质量变化率或者体积变化率表示，通过记录样品在不同时间点的降解率，获得其随时间变化的规律。

6.动物试验研究

6.1动物试验决策及设计

需按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则 第一部分：决策原则》决策是否需开展动物试验研究。如开展动物试验研究，需按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则 第二部分：试验设计、实施质量保证》进行，并遵循3R原则。需关注动物模型建立的科学性和合理性，以及对临床的借鉴意义。

对于I型胶原软骨修复产品，体内降解动物试验研究可与常规动物试验研究合并开展。I型胶原软骨修复产品的动物试验可以使用兔、犬、猪、羊等不同种属的动物模型，采用形态学、组织生物化学、生物力学分析等进行评价。动物试验方案设计宜明确的关键内容见本指导原则附录。

6.2实验动物模型的选择

实验动物模型应符合动物试验目的，建立合适的动物疾病模型用于研究，明确选择实验动物模型的依据。实验动物数量应保证结果具有可靠性，并结合统计学考虑。如选择的实验动物模型对于产品应用于人体的安全性分析具有局限性，需明确对研究结果的影响。

研发产品的生物学效应、机械性能、降解周期、降解产物同组织的相容性及组织反应研究中，宜尽量选用符合相关国家/行业标准的实验动物，有效性评价建议包含大动物试验。需要考虑I型胶原软骨修复产品的固定方式以及材料脱落风险。

6.3受试器械、对照品和实验动物数量

开发人需明确使用的受试器械和对照品，包括产品名称、结构及组成（含配合使用的附件）、型号规格、使用数量、是否重复使用等信息。受试器械应为典型性产品，对照品宜优先选择已上市的同类器械作为对照品，或对照临床常用的有效修复技术。适当时，动物试验中可设立阴性对照组和（或）空白对照组。

实验动物数量可结合研究目的、研究假设（如适用）、文献信息、同类产品经验等方面估计动物试验数量，受试器械组关键观察点实验动物数量的设定需考虑统计学分析需要。另一方面，建议预估动物试验数量时，考虑因各种原因导致实验动物过早死亡的情况。

6.4动物试验持续时间

动物试验的观察时间宜根据产品的预期用途，评价指标及降解周期选择研究持续时间，同时宜参考同类产品的研究情况。建议观察时间点及观察指标参考YY/T 0606.10。动物试验应能观察到产品降解特征且应观察到产品完全降解、吸收，并且产品对靶组织及其他组织（如适用）的影响达到稳定状态。在研究中应选择多个观察时间点，其设定应有合理依据。

6.5评价标准

按照临床标准推荐的疗效指标进行评价，并表征产品的降解特征。

在动物试验中，应对实验动物进行完整的尸检，包括大体和详细的组织病理学检查，评估指标至少包括产品降解、组织再生等情况。

6.6动物试验方案和报告要求

动物试验研究方案和研究报告应至少包括但不局限于以下内容：

试验目的

试验器材或试剂

动物的种类、数量及该种类作为受试动物的合理性解释及

选择依据

试验方法（样品准备、动物准备、手术方法）、术前准备、

目标器官/组织、手术切口控制等

对照组类型和/或对照产品的类型和选取依据

动物模型的种类及建立方法

产品的使用步骤及时间

观察方法、观察指标与观察周期

数据统计学分析过程

结果判定标准与试验结论

有效性标准

安全性指标

试验研究的结论

7.灭菌工艺研究

明确用于保证产品无菌的质量保证体系，明确灭菌工艺（方法和参数）和无菌保证水平（SAL）。采取终端灭菌的I型胶原软骨修复产品的无菌保证水平（SAL）需达到10-6。

该类产品一般为灭菌包装交付，需开展灭菌工艺验证。对于经环氧乙烷灭菌的产品，需开展灭菌结果确认和过程控制，具体可参照GB 18279系列标准。

对于经辐照灭菌的产品，需明确射线种类、辐照剂量并验证。需开展验证评价灭菌方法（包括不同辐照源）对于产品性能的影响，具体可参照GB 18280系列标准。

灭菌过程可对水凝胶或其他添加物质(例如赋形剂等)的性质产生影响。这些都宜在分析表征数据时加以考虑。在某种类别的水凝胶不适用常规灭菌方法时，宜在无菌条件下生产水凝胶,并考虑增加控制措施，例如参考药品《除菌过滤技术及应用指南》进行除菌过滤，开展相应的验证。需注意，经过滤的胶原溶液的黏度可能改变分子量，宜在除菌过滤验证中加以评估。

8.稳定性研究

申报产品需参照《无源植入性医疗器械稳定性研究指导原则》开展产品稳定性研究。在此基础上，宜将水凝胶产品储存在温度和pH值可调控的环境中。

货架有效期验证中需要明确灭菌产品的包装材料、包装工艺及方法、加速老化试验或/和实时老化试验。加速老化试验中需明确试验温度、湿度、加速老化时间的确定依据，需明确阿列纽斯方程中各项参数对凝胶组分的适用性，否则宜开展产品实时老化试验。若开发人使用其他医疗器械产品的货架有效期验证，则需证明其与本次申报产品在原材料、灭菌方法、灭菌剂量、包装材料、包装工艺、包装方式及其它影响阻菌性能的因素方面具有等同性。不同包装、不同灭菌方式的产品需分别开展验证。

货架有效期的确定需建立在科学试验的基础上，如稳定性试验，其目的是考察产品在温度、湿度、光线、重力的影响下随时间变化的规律，为产品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立产品的有效期。因此，开发人在申报产品注册时，需对包装完整性和包装强度进行评价试验，如染色液穿透试验、气泡试验、材料密封强度试验、模拟运输等，同时需结合产品性能指标要求，开展产品有效期的验证，明确内包装材料信息。

开发人需开展运输稳定性验证，可依据有关适用的国内、国际标准和验证方案进行，如：产品包装的跌落试验、振荡试验等，证明在规定的运输条件下，运输过程中环境条件（包括气压、温度、湿度等变化）不会对产品的特性和性能造成不利影响。

来源：嘉峪检测网

关键词： I型胶原软骨修复产品