Bradford法，即考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，是非常老生常谈的实验手段。但由于Bradford法灵敏度很高，仍有一定操作导致玄学的空间。在此介绍一个来自Springer Protocol的标准化方案。

2. 实验原理

 

Bradford法使用考马斯亮蓝-G作为染料。蛋白质分子在酸性条件下与考马斯亮蓝染料结合，由于蛋白质分子中组氨酸、精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸与其发生反应，将产生染料-蛋白质复合物，颜色从棕色变为蓝色，可被分光仪检测到。蛋白质浓度越高，蓝色的强度就越高。此法简单快速灵敏度高，且受到缓冲液成分干扰的影响较小，具有很强的优势。

 

（图片来源：https://www.bioagilytix.com/blog/utilizing-bradford-assay-for-protein-concentration-calculation/）

此法依然有缺点，即此反应基于组氨酸、精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸发生反应，如果待测蛋白质分子中此类氨基酸与蛋白质分子的平均数据有较大偏差，则无法准确测定。

3. 实验材料

 

所需设备：

● 移液器

● 玻璃比色皿

● 紫外分光光度计

试剂与耗材：

● 考马斯亮蓝G

● 100%乙醇

● 磷酸

● 用于绘制标准曲线的BSA

● 稀释缓冲液

● 待测蛋白样品

● 超纯水

● Whatman 1号滤纸

Bradford试剂制备：

1. 将 40mg 考马斯亮蓝-G溶解在 20mL 100%乙醇中，搅拌20分钟；

2. 继续添加 40mL 磷酸和 340mL 超纯水；

3. 用Whatman 1号滤纸过滤上述溶液两次；

4. 将所得溶液储存于棕色瓶中，存放于 4℃ 条件下。

*注意所有步骤都需要避光

4. 实验步骤

 

*样本需按用量需求分装，每次使用一管，在冰上解冻。

1. 使用BSA配制不同稀释度（从1μg到20μg）的样本用于检测并绘制在 595nm 处的吸光度标准曲线。下图提供了一种标准化的配方。

图1：引用自原文。三列配方数据从左到右分别为：稀释缓冲液、Bradford试剂、BSA标准品。

2. 根据绘制出的标准曲线，再次测定缓冲液-待测样本混合液在 595nm 处的吸光度，于标准曲线上检索得到待测样本的蛋白质浓度。

5. 标准曲线绘制

 

以X轴为浓度（以mg/mL为单位）、Y轴为吸光度（OD595），使用BSA标准品的数据绘制标准曲线。为确保精度，需拟合最佳曲线。示例如下图。

图2：引用自原文。左侧为一组BSA标准品的数据，右侧为基于左侧数据拟合的标准曲线。

6. 注意事项

 

1. Bradford法的高灵敏度适用于较低的蛋白质浓度。如果待测样本的浓度超出可检测的范围，应先进行梯度稀释，稀释到吸光度落入可检测的有效范围；

2. 样本中的表面活性剂（如总蛋白提取缓冲液中就存在）会干扰此法检测效果；

3. 注意在1小时内检测吸光度，保证三个技术性重复；

4. 移液操作需要精准，因为Bradford本身就是用于测量低浓度蛋白质，移液操作的失误可能导致数据玄学

5. 需注意待测蛋白中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸含量是否与平均水平有较大偏差，如果有则不能使用Bradford法，可结合具体分子考虑Lowry法、BCA法或紫外分光法。

7. 参考文献

 

Varsha Gupta and Baishnab Charan Tripathy, 2020, Detection of Phosphoproteins (Phosphoserine and Phosphothreonine) from Thylakoid Membranes Using Western Blotting, from Experimental Protocols in Biotechnology, P143-145, Humana Press