生物胺是一类含氮的低相对分子质量且具有生物活性的碱性有机胺类化合物，由对应的氨基酸通过生物作用脱羧形成，也可通过醛类、酮类有机物在氨基酸转氨酶作用下产生。生物胺主要存在各类食品（如乳制品、饮料、鱼类水产品以及葡萄酒、黄酒等发酵食品）中，是生命体内的活性成分，具有一定的生理功能，对内脏功能和免疫系统的代谢过程有非常重要的作用，但摄入过多会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应，严重的还会损害人体神经系统和心血管系统，甚至危及生命。

 

葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原材料，经发酵酿制而成，发酵酿制酒中生物胺的含量随着原料品种、国度、气候、产区和酿造工艺等变化。经发酵后的葡萄酒可能会有单宁带来的粗糙、苦涩以及酸类物质带来的刺激口感，因此需要通过一段时间的陈酿来改善品质。黄酒是以稻米、小麦等为主要原料，经发酵等工艺勾兑而成的饮料酒，黄酒中生物胺含量与乳酸菌、酸度、温度等密切相关。乙醇会加强生物胺的毒性，因此生物胺在酒类中的限量标准要严于其他产品。我国制定了水产品高组胺鱼类中HIS限 量 值 为 400mg·kg−1，其他鱼类中HIS限量值为200mg·kg−1，对于酒类暂未制定相应标准限量值，但文献报道白酒和黄酒中均检出生物胺。生物胺分布广，含量波动范围大，随着人民生活水平的不断提高，对食品研究的不断深入，全世界将会更加详细制定各食品类中生物胺的限量标准，以保障人类生命健康安全。

 

目前已有很多生物胺的检测方法，如液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、超高效液相色谱法等，在 GB 5009.208— 2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》中仅涉及液相色谱法和分光光度法，其操作繁琐，检测时间长，且不涉及气相色谱法。由于生物胺挥发性不强，不易气化，需要将生物胺转化成氨基甲酸酯类化合物以便分析。基于此，研究人员采用分散液液微萃取技术进行前处理，以氯甲酸异丁酯为衍生试剂，提出了气相色谱-质谱法同时测定葡萄酒和黄酒中7种生物胺 [2-苯乙胺（2-PEA）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、HIS、色胺（TRY）、酪胺（TYR）、章鱼胺（OA）]含量的方法。

 

1.试验方法

 

取葡萄酒或黄酒样品，加入内标溶液、饱和碳酸氢钠溶液（维持样品溶液pH在9.5~10.0内）和PVPP，涡旋净化，离心后取上清液，加入衍生试剂氯甲酸异丁酯，室温涡旋反应。加入乙醇、二氯甲烷，进一步涡旋提取，离心后取下层二氯甲烷提取液，经无水硫酸钠脱水后按照仪器工作条件测定。

 

2.结果与讨论

 

2.1 色谱行为

 

生物胺本身不容易气化，但伯胺、仲胺可以与氯甲酸异丁酯发生衍生化反应，生成的氨基甲酸酯衍生物容易气化。5mg·L−1混合标准溶液中各单生物胺衍生物的总离子流色谱图见图1。

 

由图1可知，7种生物胺的衍生物在DB-5MS毛细管色谱柱上分离较好。

 

2.2 特征离子的选择

 

对衍生物质谱进行解析，以确保获得的特征离子是目标化合物衍生产物的。以HIS为例，其衍生物通过质谱分析得到以下碎片离子m/z 311，238，194，182，138，94，82，57，如图2所示。

 

由图2可知，m/z 311为HIS衍生物的分子离子 [M]+，m/z 194为分子离子失去氨基甲酸异丁酯形成的碎片离子[M-117]+，而m/z 182，138，94，82，57是碎片离子[M-117]+进一步分解形成的子碎片离子，选取其中m/z 311，194，182这3个非色谱柱流失离子为HIS的特征离子，其中m/z 194为定量离子。HIS衍生产物碎片离子的解析见图3。

 

 

2.3 衍生时溶液酸度的选择

 

分别向6组12支锥形试管准确加入 50mg·L−1混合标准溶液100μL，加入 50mg·L−1内标溶液100μL，每一组加入不同酸度（pH分别为9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0）的缓冲溶液200μL，混匀，分别加入50μL氯甲酸异丁酯进行衍生，涡旋混匀5min，向锥形试管中加入500μL乙酸乙酯提取，涡旋提取后离心，吸取上层乙酸乙酯提取液上机检测。结果显示，衍生时溶液pH在9.5~10.0时检测响应值较高且稳定，因此试验选择饱和碳酸氢钠溶液来调节样品溶液的pH，使 pH维持在9.5~10.0内。

 

2.4 净化及萃取条件的选择

 

酒中可能包含脂溶性杂质，会干扰试验结果，考虑在分析前通过加入有机溶剂二氯甲烷或乙酸乙酯除去部分脂溶性杂质。准确吸取3份50mg·L−1混合标准溶液100μL，加入50mg·L−1内标溶液100μL，再加入300μL饱和碳酸氢钠溶液，混匀，其中一份加入200μL二氯甲烷提取，另一份加入200μL乙酸乙酯，一份不做任何处理。涡旋提取后离心，弃去除杂液体，定容至1mL，加入氯甲酸异丁酯，涡旋提取，向溶液中加入乙酸乙酯，涡旋提取，离心 ，取乙酸乙酯提取液上机检测。经分析发现，有机溶剂除杂效果不明显，且回收率不满足试验要求。

 

PVPP是一种水溶性高分子化合物，既能溶于水，又溶于大部分有机溶剂，拥有良好的络合能力，在食品、医疗行业常作为澄清剂、吸附剂等，可吸附酒中一些沉淀物而去除杂质干扰。取3组试管，每组准确吸取 空白水样，加入50mg·L−1混合标准溶液、50mg·L−1内标溶液、饱和碳酸氢钠溶液和PVPP，涡旋混匀后离心，将液体全部转移至新的锥形试管后采用 2.4节中上述方法继续衍生分析。结果显示，加入PVPP后，空白加标样品中生物胺的回收率为86.6%~104%，相对标准偏差（RSD）为0.27%~5.0%，说明加入PVPP不会干扰测定结果。因此，试验选择在样品中加入PVPP去除酒中色素、沉淀等杂质。

 

另外，参考液液微萃取反应条件，将提取时的乙酸乙酯试剂更改为衍生结束加入乙醇、二氯甲烷。试验结果表明，使用二氯甲烷提取时生物胺衍生物的响应值优于乙酸乙酯提取时的，因此试验最终选择以二氯甲烷为萃取剂。

 

2.5 标准曲线

 

取适量的50mg·L−1混合标准溶液，按照前述试验方法衍生并处理，得到各生物胺的质量浓度为0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mg·L−1，内标质量浓度为5.0mg·L−1的混合标准溶液系列，并按照仪器工作条件测定，以生物胺与内标的质量比为横坐标，以对应生物胺衍生物与内标的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，各生物胺标准曲线的线性范围均为0.2~10.0mg·L−1，线性回归方程

 

和相关系数见表1。

 

表1 线性参数

2.6 检出限、测定下限、精密度和回收试验

 

分别对葡 萄 酒 和 黄 酒 样 品 进 行0.5，2.0，5.0mg·L−1等3个浓度水平的加标回收试验，计算回收率和测定值的RSD，结果见表2。若样品中生物胺含量超出线性范围，稀释至合适质量浓度再进行分析。

 

表2 精密度和回收试验结果（n=6）

由表2可知，在葡萄酒和黄酒样品中进行0.5，2.0，5.0mg·L−1浓度水平的加标后，各生物胺的回收率为83.3%~116%，测定值的RSD为0.70%~9.4%，说明方法完全可以满足澳大利亚、德国等国家生物胺（HIS）限量规定要求（2~10mg·L−1）。当取1mL样品时，确定本方法7种生物胺的测定下限均为0.2mg·kg−1，检出限均为0.1mg·kg−1。

 

2.7 样品分析

 

按照试验方法测定7份酒样（4份葡萄酒和3份黄酒）中7种生物胺的含量，结果见表3。若样品中生物胺含量超出线性范围，稀释至合适质量浓度再进行分析。

 

表3 样品分析结果

根据澳大利亚法规要求，本次试验抽检的葡萄酒样品中HIS未超过限量要求（10mg·L−1），黄酒中则超过该限量值。从本次检测结果看，PUT和HIS在生物胺中含量最高，占总生物胺含量的1/2以上，甚至达总量的 89%，葡萄酒中生物胺含量水平的差异，可能是原材料、生产技术、储藏方式等不同引起的。

 

3. 试验结论

 

研究人员采用PVPP进行除杂，氯甲酸异丁酯进行衍生化，乙醇、二氯甲烷进行萃取，以气相色谱-质谱法同时测定葡萄酒和黄酒中7 种生物胺的含量，方法简便、快速、准确，满足检测要求。通过数据分析及文献查阅发现酒中HIS在不同国家的限量值不同，虽然暂未超过澳大利亚等国家对HIS的限量要求，基于生物胺的毒性，我国也应该出台相关标准，加强酿制酒生产源头、工艺流程的管理，以提升酿制酒质量安全，保障人民的健康发展。

 

作者：周江平1，木玉仙1，和春映1，翟江舸1，赵永信2，吴平谷2

 

单位：1. 古城区疾病预防控制中心；

 

2. 浙江省疾病预防控制中心

 

来源：《理化检验-化学分册》2025年第3期

 

 

来源：理化检验化学分册

关键词： 生物胺 葡萄酒