嘉峪检测网 2025-06-09 20:18
导读:本文介绍了高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点,旨在分享经验所得。
引言
高效液相色谱法(HPLC)是制药行业分析检测的主要手段,也是分析工作者首当其冲需要掌握的一门技术。随着2025药典的发布与实施,液相检测技术也迎来了新的挑战。
2025年版《中国药典》二部对110多个品种标准有关物质检查项进行了增加或修订。以青霉胺为例,2020年版药典标准采用HPLC-UV法,仅能控制青霉胺二硫化物,未控制其他有关物质,美国药典与欧洲药典也仅能控制青霉胺二硫化物。2025药典采用HPLC- ELSD法,提高了方法的灵敏度和杂质检测能力,对青霉胺二硫化物和其他杂质均实现了有效控制【1】。
随着药典标准的不断升级和优化,某些品种采用传统的HPLC-UV检测法,已无法满足质量控制的需求,从而逐渐被新的检测器所替代。
检测器作为观测化合物出峰的“眼睛”,在高效液相色谱法中承担着举足轻重的地位,选错检测器势必导致有眼如盲。
本文介绍了高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点,旨在分享经验所得。
HPLC中常见的检测器种类及其原理
HPLC中使用最为普遍的是UV检测器,其原理是基于化合物吸收特定波长的UV光产生响应。然而,并非所有的化合物均有紫外吸收,某些化合物即使在低波长下,紫外响应也可能较弱,无法满足分析方法灵敏度的要求。故而,在正式进行分析方法开发前,应对待测化合物的结构进行分析,初步评估常规的UV检测器是否能满足基本检测需求,即“是否有响应”。
通常含有共轭体系的化合物在紫外光区均有吸收,如不饱和脂肪酸、醛、酮以及芳香化合物等。几乎所有的芳香族化合物在 260nm下都有非常强烈的吸收,拥有一个或者更多双键的化合物可以在波长小于215nm 时被检测到【2】。至于“是否能灵敏检出”,除了化合物本身的紫外吸收属性,还取决于方法选择的波长、供试品的浓度、进样体积以及对灵敏度要求的高低,方法灵敏度最终需要实际的数据支持。
对于有紫外吸收但是经过UV光的辐射激发能产生荧光的化合物,可以选择荧光检测器(FLD)来获得更高的灵敏度,从而用于痕量测定。如α-三联噻吩,使用荧光检测器获取的检出限为0.5 ng/mL,使用二极管阵列检测器获取的检出限为100 ng/mL,两种检测器的灵敏度相差了200倍【3】。
对于没有紫外吸收的化合物,可以选择通用检测器,分析实验室最常见的就是示差检测器(RID)和蒸发光散射检测器(ELSD)。近年来,电雾式检测器(CAD)作为ELSD或RID的替代检测器,由于其出色的灵敏度和重复性,逐渐崭露头角。
RID的原理是利用被检测分子的折光系数与流动相的差异,差异越大,检测的灵敏度越高。然而,RID的灵敏度相比其他检测器而言,最佳情况下也只能算个中等水平,故而不适用于痕量测定。药品检验中,通常用于一些糖类、醇类的含量测定或者聚合物分子量的测定,如HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量【4】、HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量【5】、高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布【6】。
同样作为通用检测器,ELSD的灵敏度一般情况下比RID要高出10~100倍【2】。ELSD的原理是在流动相蒸发的基础上,测量非挥发性溶质颗粒造成的光散射,因此测量灵敏度会随着待测分析物的挥发性增加而减弱。ELSD通常用于检测磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等化合物,比如HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量【7】。另外,ELSD也可用于无机离子的含量测定【8】。
CAD基于雾化的原理,洗脱液雾化后形成颗粒,经过蒸发管干燥后与带电氮气碰撞,使得分析物颗粒表面带正电荷,分析物颗粒的质量与表面所带电荷量相关。由于CAD的通用性强及定量范围宽等优势,其在皂苷类、生物碱类、类黄酮及有机酸类等天然产物的质量分析中具有广泛的应用【9】。
MS检测器在研发领域使用也很广泛,其原理是利用电磁学原理,将待测样品分子解离成具有不同质量的离子,然后按其质荷比(m/z)的大小依次排列收集成质谱,可用来提供分析物的相对分子量和结构信息,常用于化合物的结构确证。但MS检测器成本较高、对实验人员的专业技能要求也高。
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不同检测器使用时的考虑要点
考虑要点1-流动相:
UV检测器要求使用的流动相无吸收,或在被测组分吸收波长处无吸收,因此方法选择的波长应大于流动相的截止波长。RID要求流动相和待测化合物折射率有差异,差异越大,灵敏度越高。ELSD、CAD、MS均要求流动相具有挥发性,而且不含有非挥发性的添加剂(比如磷酸盐)。对于UV检测器,由于流动相中可使用非挥发性缓冲盐,使用时应注意缓冲盐浓度与有机溶剂比例,防止盐析。
下图【2】分别提供了一些常见的缓冲液和溶剂的相关参数,为流动相选择提供参考。
缓冲液a | 紫外吸收截止波长b | 备注 |
---|---|---|
三氯乙酸 | 210nm (0.1%) | 离子对,挥发性 |
磷酸 | <200nm (10mmol/L) | 有限溶解度 |
一磷酸盐 | <200nm (10mmol/L) | 有限溶解度 |
二磷酸盐 | <200nm (10mmol/L) | 有限溶解度 |
枸橼酸 | 230nm (10mmol/L) | 有限溶解度 |
一枸橼酸盐 | 230nm (10mmol/L) | 腐蚀仪器c |
二枸橼酸盐 | 230nm (10mmol/L) | 腐蚀仪器c |
甲酸 | 210nm (10mmol/L) | 腐蚀仪器c |
乙酸 | 210nm (10mmol/L) | 挥发性 |
碳酸 | <200nm (10mmol/L) | 挥发性 |
碳酸盐 | <200nm (10mmol/L) | 挥发性d |
双-三丙烷·盐酸 (Bis-tris propane.HCl∗) | 215nm (10mmol/L) | 挥发性e |
双-三丙烷 (Bis-tris propane) | 225nm (10mmol/L) | 不稳定f |
氨基丁三醇·盐酸 (Tris.HCl∗) | 205nm (10mmol/L) | 不稳定f |
氨水·HCl | 200nm (10mmol/L) | 不稳定f |
原硼酸 | 200nm (10mmol/L) | |
原硼酸—盐 | 200nm (10mmol/L) | |
1-甲基哌啶·盐酸 | 215nm (10mmol/L) | 不稳定f |
三乙胺·盐酸 | <200nm (10mmol/L) | 不稳定f |
溶剂 | 紫外截止使用波长 (nm)a[2] | Rlb[3] |
---|---|---|
丙酮 | 330 | 1.359 |
乙腈 | 190 | 1.344 |
正丁醇 | 215 | 1.399 |
1-氯丁烷 | 220 | 1.402 |
氯仿 | 245 | 1.446 |
环己烷 | 200 | 1.424 |
二甲基甲酰胺 | 268 | 1.430 |
二甲基亚砜 | 268 | 1.478 |
1,4-二氧六环 | 215 | 1.422 |
乙酸乙酯 | 256 | 1.372 |
庚烷 | 200 | 1.388 |
正己烷 | 195 | 1.375 |
异辛烷 | 215 | 1.391 |
甲醇 | 205 | 1.328 |
甲基叔丁基醚 | 210 | 1.369 |
甲基乙基酮 | 329 | 1.379 |
二氯甲烷 | 233 | 1.424 |
异丙醇 | 205 | 1.377 |
正丙醇 | 210 | 1.386 |
四氢呋喃 | 212 | 1.407 |
甲苯 | 284 | 1.497 |
水 | 190 | 1.333 |
考虑要点2-洗脱方式:
RID一般不适用于梯度洗脱,因为在梯度情况下匹配参比池和样品池的折射率是极其困难的(RID包含参比池和样品池,使用前用流动相冲洗参比池,以流动相为背景做参比,假设采用梯度洗脱方式,实际的背景一直在变,可参比池却不能紧跟其变,故而影响响应)。
RID用于等度洗脱时也不如UV省心, 流动相未脱气、中途更换流动相、流动相挥发等都更容易造成RI基线漂移,故而在实际实验过程中,应尽可能地一次性配制足够多的流动相,并且充分脱气,避免实验中途添加流动相或者更换流动相瓶,若流动相中含有挥发性溶剂,应用封口膜缠绕瓶口,防止流动相挥发。最后值得关注的一点是,尽可能地采用单元泵。
其他几款检测器,如UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD,均可用于梯度洗脱。
实际使用时,UV检测器若采用梯度洗脱方式,应尽量避免采用UV吸光度差异较大的两相作为流动相,比如四氢呋喃和水,若必须使用,可考虑在水相中混入一定比例的有机相,降低两相间差异;另外一个方式是选择更高一点的波长(这个措施往往不是很实际,除非待测化合物在高波长处有较好的吸收)。
考虑要点3-温度:
UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD受温度的影响均较小,但RID对温度变化敏感,主要体现在:对环境温度敏感、对柱温和检测器温度差异敏感。因此,实际使用之前建议至少提前半小时预热机器,夏天要及时开启空调保持环境温度可控,方法设置时应避免柱温和检测器温度差异过大。
笔者感悟
每种检测器都有它的优点和使用限制,合理运用、扬长避短,才能发挥它们的核心价值。
参考文献
【1】 2025年版《中国药典》二部主要增修订内容解读
【2】 现代液相色谱导论
【3】 高效液相色谱-荧光检测法测定化妆品中α-三联噻吩
【4】 HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量
【5】 HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量
【6】 高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布
【7】 HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量
【8】 亲水作用色谱–蒸发光散射法测定甲基纤维素中氯离子
【9】 电喷雾检测器的工作特点及其在药物分析中的应用进展
来源:智药公会