引言

高效液相色谱法（HPLC）是制药行业分析检测的主要手段，也是分析工作者首当其冲需要掌握的一门技术。随着2025药典的发布与实施，液相检测技术也迎来了新的挑战。

2025年版《中国药典》二部对110多个品种标准有关物质检查项进行了增加或修订。以青霉胺为例，2020年版药典标准采用HPLC-UV法，仅能控制青霉胺二硫化物,未控制其他有关物质,美国药典与欧洲药典也仅能控制青霉胺二硫化物。2025药典采用HPLC- ELSD法，提高了方法的灵敏度和杂质检测能力,对青霉胺二硫化物和其他杂质均实现了有效控制【1】。

随着药典标准的不断升级和优化，某些品种采用传统的HPLC-UV检测法，已无法满足质量控制的需求，从而逐渐被新的检测器所替代。

检测器作为观测化合物出峰的“眼睛”，在高效液相色谱法中承担着举足轻重的地位，选错检测器势必导致有眼如盲。

本文介绍了高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点，旨在分享经验所得。

 

HPLC中常见的检测器种类及其原理

HPLC中使用最为普遍的是UV检测器，其原理是基于化合物吸收特定波长的UV光产生响应。然而，并非所有的化合物均有紫外吸收，某些化合物即使在低波长下，紫外响应也可能较弱，无法满足分析方法灵敏度的要求。故而，在正式进行分析方法开发前，应对待测化合物的结构进行分析，初步评估常规的UV检测器是否能满足基本检测需求，即“是否有响应”。

通常含有共轭体系的化合物在紫外光区均有吸收，如不饱和脂肪酸、醛、酮以及芳香化合物等。几乎所有的芳香族化合物在 260nm下都有非常强烈的吸收，拥有一个或者更多双键的化合物可以在波长小于215nm 时被检测到【2】。至于“是否能灵敏检出”，除了化合物本身的紫外吸收属性，还取决于方法选择的波长、供试品的浓度、进样体积以及对灵敏度要求的高低，方法灵敏度最终需要实际的数据支持。

对于有紫外吸收但是经过UV光的辐射激发能产生荧光的化合物，可以选择荧光检测器（FLD）来获得更高的灵敏度，从而用于痕量测定。如α-三联噻吩，使用荧光检测器获取的检出限为0.5 ng/mL，使用二极管阵列检测器获取的检出限为100 ng/mL，两种检测器的灵敏度相差了200倍【3】。

对于没有紫外吸收的化合物，可以选择通用检测器，分析实验室最常见的就是示差检测器（RID）和蒸发光散射检测器（ELSD）。近年来，电雾式检测器（CAD）作为ELSD或RID的替代检测器，由于其出色的灵敏度和重复性，逐渐崭露头角。

RID的原理是利用被检测分子的折光系数与流动相的差异，差异越大，检测的灵敏度越高。然而，RID的灵敏度相比其他检测器而言，最佳情况下也只能算个中等水平，故而不适用于痕量测定。药品检验中，通常用于一些糖类、醇类的含量测定或者聚合物分子量的测定，如HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量【4】、HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量【5】、高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布【6】。

同样作为通用检测器，ELSD的灵敏度一般情况下比RID要高出10~100倍【2】。ELSD的原理是在流动相蒸发的基础上，测量非挥发性溶质颗粒造成的光散射，因此测量灵敏度会随着待测分析物的挥发性增加而减弱。ELSD通常用于检测磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等化合物，比如HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量【7】。另外，ELSD也可用于无机离子的含量测定【8】。

CAD基于雾化的原理，洗脱液雾化后形成颗粒，经过蒸发管干燥后与带电氮气碰撞，使得分析物颗粒表面带正电荷，分析物颗粒的质量与表面所带电荷量相关。由于CAD的通用性强及定量范围宽等优势，其在皂苷类、生物碱类、类黄酮及有机酸类等天然产物的质量分析中具有广泛的应用【9】。

MS检测器在研发领域使用也很广泛，其原理是利用电磁学原理，将待测样品分子解离成具有不同质量的离子，然后按其质荷比(m/z)的大小依次排列收集成质谱，可用来提供分析物的相对分子量和结构信息，常用于化合物的结构确证。但MS检测器成本较高、对实验人员的专业技能要求也高。

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不同检测器使用时的考虑要点

考虑要点1-流动相：

UV检测器要求使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收，因此方法选择的波长应大于流动相的截止波长。RID要求流动相和待测化合物折射率有差异，差异越大，灵敏度越高。ELSD、CAD、MS均要求流动相具有挥发性，而且不含有非挥发性的添加剂(比如磷酸盐)。对于UV检测器，由于流动相中可使用非挥发性缓冲盐，使用时应注意缓冲盐浓度与有机溶剂比例，防止盐析。

下图【2】分别提供了一些常见的缓冲液和溶剂的相关参数，为流动相选择提供参考。

 

 

考虑要点2-洗脱方式：

RID一般不适用于梯度洗脱，因为在梯度情况下匹配参比池和样品池的折射率是极其困难的（RID包含参比池和样品池，使用前用流动相冲洗参比池，以流动相为背景做参比，假设采用梯度洗脱方式，实际的背景一直在变，可参比池却不能紧跟其变，故而影响响应）。

RID用于等度洗脱时也不如UV省心， 流动相未脱气、中途更换流动相、流动相挥发等都更容易造成RI基线漂移，故而在实际实验过程中，应尽可能地一次性配制足够多的流动相，并且充分脱气，避免实验中途添加流动相或者更换流动相瓶，若流动相中含有挥发性溶剂，应用封口膜缠绕瓶口，防止流动相挥发。最后值得关注的一点是，尽可能地采用单元泵。

其他几款检测器，如UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD，均可用于梯度洗脱。

实际使用时，UV检测器若采用梯度洗脱方式，应尽量避免采用UV吸光度差异较大的两相作为流动相，比如四氢呋喃和水，若必须使用，可考虑在水相中混入一定比例的有机相，降低两相间差异；另外一个方式是选择更高一点的波长（这个措施往往不是很实际，除非待测化合物在高波长处有较好的吸收）。

考虑要点3-温度：

UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD受温度的影响均较小，但RID对温度变化敏感，主要体现在：对环境温度敏感、对柱温和检测器温度差异敏感。因此，实际使用之前建议至少提前半小时预热机器，夏天要及时开启空调保持环境温度可控，方法设置时应避免柱温和检测器温度差异过大。

 

笔者感悟

每种检测器都有它的优点和使用限制，合理运用、扬长避短，才能发挥它们的核心价值。

 

参考文献

【1】    2025年版《中国药典》二部主要增修订内容解读

【2】    现代液相色谱导论

【3】    高效液相色谱-荧光检测法测定化妆品中α-三联噻吩

【4】    HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量

【5】    HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量

【6】    高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布

【7】    HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量

【8】    亲水作用色谱–蒸发光散射法测定甲基纤维素中氯离子

【9】    电喷雾检测器的工作特点及其在药物分析中的应用进展

 

来源：智药公会

关键词： 中国药典 高效液相色谱法