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2025年版中国药典高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点

嘉峪检测网 2025-06-09 20:18

导读:本文介绍了高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点,旨在分享经验所得。

引言

高效液相色谱法(HPLC)是制药行业分析检测的主要手段,也是分析工作者首当其冲需要掌握的一门技术。随着2025药典的发布与实施,液相检测技术也迎来了新的挑战。

2025年版《中国药典》二部对110多个品种标准有关物质检查项进行了增加或修订。以青霉胺为例,2020年版药典标准采用HPLC-UV法,仅能控制青霉胺二硫化物,未控制其他有关物质,美国药典与欧洲药典也仅能控制青霉胺二硫化物。2025药典采用HPLC- ELSD法,提高了方法的灵敏度和杂质检测能力,对青霉胺二硫化物和其他杂质均实现了有效控制【1】。

随着药典标准的不断升级和优化,某些品种采用传统的HPLC-UV检测法,已无法满足质量控制的需求,从而逐渐被新的检测器所替代。

检测器作为观测化合物出峰的“眼睛”,在高效液相色谱法中承担着举足轻重的地位,选错检测器势必导致有眼如盲。

本文介绍了高效液相色谱法中常见检测器的特点和使用考虑要点,旨在分享经验所得。

 

HPLC中常见的检测器种类及其原理

HPLC中使用最为普遍的是UV检测器,其原理是基于化合物吸收特定波长的UV光产生响应。然而,并非所有的化合物均有紫外吸收,某些化合物即使在低波长下,紫外响应也可能较弱,无法满足分析方法灵敏度的要求。故而,在正式进行分析方法开发前,应对待测化合物的结构进行分析,初步评估常规的UV检测器是否能满足基本检测需求,即“是否有响应”。

通常含有共轭体系的化合物在紫外光区均有吸收,如不饱和脂肪酸、醛、酮以及芳香化合物等。几乎所有的芳香族化合物在 260nm下都有非常强烈的吸收,拥有一个或者更多双键的化合物可以在波长小于215nm 时被检测到【2】。至于“是否能灵敏检出”,除了化合物本身的紫外吸收属性,还取决于方法选择的波长、供试品的浓度、进样体积以及对灵敏度要求的高低,方法灵敏度最终需要实际的数据支持。

对于有紫外吸收但是经过UV光的辐射激发能产生荧光的化合物,可以选择荧光检测器(FLD)来获得更高的灵敏度,从而用于痕量测定。如α-三联噻吩,使用荧光检测器获取的检出限为0.5 ng/mL,使用二极管阵列检测器获取的检出限为100 ng/mL,两种检测器的灵敏度相差了200倍【3】。

对于没有紫外吸收的化合物,可以选择通用检测器,分析实验室最常见的就是示差检测器(RID)和蒸发光散射检测器(ELSD)。近年来,电雾式检测器(CAD)作为ELSD或RID的替代检测器,由于其出色的灵敏度和重复性,逐渐崭露头角。

RID的原理是利用被检测分子的折光系数与流动相的差异,差异越大,检测的灵敏度越高。然而,RID的灵敏度相比其他检测器而言,最佳情况下也只能算个中等水平,故而不适用于痕量测定。药品检验中,通常用于一些糖类、醇类的含量测定或者聚合物分子量的测定,如HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量【4】、HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量【5】、高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布【6】。

同样作为通用检测器,ELSD的灵敏度一般情况下比RID要高出10~100倍【2】。ELSD的原理是在流动相蒸发的基础上,测量非挥发性溶质颗粒造成的光散射,因此测量灵敏度会随着待测分析物的挥发性增加而减弱。ELSD通常用于检测磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等化合物,比如HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量【7】。另外,ELSD也可用于无机离子的含量测定【8】。

CAD基于雾化的原理,洗脱液雾化后形成颗粒,经过蒸发管干燥后与带电氮气碰撞,使得分析物颗粒表面带正电荷,分析物颗粒的质量与表面所带电荷量相关。由于CAD的通用性强及定量范围宽等优势,其在皂苷类、生物碱类、类黄酮及有机酸类等天然产物的质量分析中具有广泛的应用【9】。

MS检测器在研发领域使用也很广泛,其原理是利用电磁学原理,将待测样品分子解离成具有不同质量的离子,然后按其质荷比(m/z)的大小依次排列收集成质谱,可用来提供分析物的相对分子量和结构信息,常用于化合物的结构确证。但MS检测器成本较高、对实验人员的专业技能要求也高。

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不同检测器使用时的考虑要点

考虑要点1-流动相:

UV检测器要求使用的流动相无吸收,或在被测组分吸收波长处无吸收,因此方法选择的波长应大于流动相的截止波长。RID要求流动相和待测化合物折射率有差异,差异越大,灵敏度越高。ELSD、CAD、MS均要求流动相具有挥发性,而且不含有非挥发性的添加剂(比如磷酸盐)。对于UV检测器,由于流动相中可使用非挥发性缓冲盐,使用时应注意缓冲盐浓度与有机溶剂比例,防止盐析。

下图【2】分别提供了一些常见的缓冲液和溶剂的相关参数,为流动相选择提供参考。

 

缓冲液aa 紫外吸收截止波长bb 备注
三氯乙酸 210nm (0.1%) 离子对,挥发性
磷酸 <200nm (10mmol/L) 有限溶解度
一磷酸盐 <200nm (10mmol/L) 有限溶解度
二磷酸盐 <200nm (10mmol/L) 有限溶解度
枸橼酸 230nm (10mmol/L) 有限溶解度
一枸橼酸盐 230nm (10mmol/L) 腐蚀仪器cc
二枸橼酸盐 230nm (10mmol/L) 腐蚀仪器cc
甲酸 210nm (10mmol/L) 腐蚀仪器cc
乙酸 210nm (10mmol/L) 挥发性
碳酸 <200nm (10mmol/L) 挥发性
碳酸盐 <200nm (10mmol/L) 挥发性dd
双-三丙烷·盐酸 (Bis-tris propane.HCl∗) 215nm (10mmol/L) 挥发性ee
双-三丙烷 (Bis-tris propane) 225nm (10mmol/L) 不稳定ff
氨基丁三醇·盐酸 (Tris.HCl∗) 205nm (10mmol/L) 不稳定ff
氨水·HCl 200nm (10mmol/L) 不稳定ff
原硼酸 200nm (10mmol/L)  
原硼酸—盐 200nm (10mmol/L)  
1-甲基哌啶·盐酸 215nm (10mmol/L) 不稳定ff
三乙胺·盐酸 <200nm (10mmol/L) 不稳定ff

 

溶剂 紫外截止使用波长 (nm)aa[2] Rlbb[3]
丙酮 330 1.359
乙腈 190 1.344
正丁醇 215 1.399
1-氯丁烷 220 1.402
氯仿 245 1.446
环己烷 200 1.424
二甲基甲酰胺 268 1.430
二甲基亚砜 268 1.478
1,4-二氧六环 215 1.422
乙酸乙酯 256 1.372
庚烷 200 1.388
正己烷 195 1.375
异辛烷 215 1.391
甲醇 205 1.328
甲基叔丁基醚 210 1.369
甲基乙基酮 329 1.379
二氯甲烷 233 1.424
异丙醇 205 1.377
正丙醇 210 1.386
四氢呋喃 212 1.407
甲苯 284 1.497
190 1.333

考虑要点2-洗脱方式:

RID一般不适用于梯度洗脱,因为在梯度情况下匹配参比池和样品池的折射率是极其困难的(RID包含参比池和样品池,使用前用流动相冲洗参比池,以流动相为背景做参比,假设采用梯度洗脱方式,实际的背景一直在变,可参比池却不能紧跟其变,故而影响响应)。

RID用于等度洗脱时也不如UV省心, 流动相未脱气、中途更换流动相、流动相挥发等都更容易造成RI基线漂移,故而在实际实验过程中,应尽可能地一次性配制足够多的流动相,并且充分脱气,避免实验中途添加流动相或者更换流动相瓶,若流动相中含有挥发性溶剂,应用封口膜缠绕瓶口,防止流动相挥发。最后值得关注的一点是,尽可能地采用单元泵。

其他几款检测器,如UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD,均可用于梯度洗脱。

实际使用时,UV检测器若采用梯度洗脱方式,应尽量避免采用UV吸光度差异较大的两相作为流动相,比如四氢呋喃和水,若必须使用,可考虑在水相中混入一定比例的有机相,降低两相间差异;另外一个方式是选择更高一点的波长(这个措施往往不是很实际,除非待测化合物在高波长处有较好的吸收)。

考虑要点3-温度:

UV检测器、MS、CAD、ELSD、FLD受温度的影响均较小,但RID对温度变化敏感,主要体现在:对环境温度敏感、对柱温和检测器温度差异敏感。因此,实际使用之前建议至少提前半小时预热机器,夏天要及时开启空调保持环境温度可控,方法设置时应避免柱温和检测器温度差异过大。

 

笔者感悟

每种检测器都有它的优点和使用限制,合理运用、扬长避短,才能发挥它们的核心价值。

 

参考文献

【1】    2025年版《中国药典》二部主要增修订内容解读

【2】    现代液相色谱导论

【3】    高效液相色谱-荧光检测法测定化妆品中α-三联噻吩

【4】    HPLC-RID法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量

【5】    HPLC-RID法测定磷酸奥司他韦干混悬剂中山梨醇的含量

【6】    高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布

【7】    HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量

【8】    亲水作用色谱–蒸发光散射法测定甲基纤维素中氯离子

【9】    电喷雾检测器的工作特点及其在药物分析中的应用进展

 

来源:智药公会

关键词: 中国药典 高效液相色谱法

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