摘 要： 建立了快速滤过型净化结合气相色谱-串联质谱同时测定杏花中55种农药残留的方法。选用多种产地的杏花样品，采用复杂基质快速滤过型净化小柱对其提取净化，选择气相色谱-三重四极杆质谱多反应监测模式，用基质标准曲线定量法分析杏花样品，通过对气相色谱、质谱条件调控，提取溶剂和净化条件选择，基质效应抵消等优化实验条件，实现对实际杏花样品的农药残留测定。结果表明，多数农药在杏花样品中的基质效应影响无法忽略，进而采用空白基质来抵消基质效应影响，55种农药在质量浓度为15～1 000 ng/mL内线性关系良好，线性相关系数为0.990～0.999 5，检出限为3.75～15 μg/kg，定量限为10～45 μg/kg；在3个添加浓度（40、90、200 μg/kg）下55种化合物的平均加标回收率分别为74.6%～114.1%，75.3%～109.1%和81.5%～112.6%，测定结果的相对标准偏差分别为1.2%～9.3%，1.3%～9.4%和0.7%～9.4%(n=6)。与传统的QuEChERS技术和固相萃取法相比较，该方法快速简便、精密度和灵敏度良好、成本低廉，可满足杏花中55种农药残留的检测要求。

关键词： 气相色谱-串联质谱； 快速滤过型净化； 农药残留； 杏花； 中药材

 

杏花为植物杏或山杏的干燥花，其味苦，性温，无毒。杏花具有丰富的药用和食疗价值，经常被用于活血补虚[1]等方面。研究发现，杏花含有葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖等成分[2]。现代科学研究进一步揭示，杏花的成分较为复杂，其主要含有苦杏仁苷、总黄酮类、植物激素、挥发性成分及其他成分[3]。当前，杏的种植主要分布在我国河北、山西、山东、河南、新疆、内蒙古等地区，随着环境中农药残留的富集，以及植物病虫害状况时有发生，农药的使用种类、频率及用量均呈现上升趋势，其农药残留问题不容小觑。建立一种快速、准确的方法，用于测定杏花中多种农药残留，对于有效监测杏花的农药残留状况、保障其质量安全具有重要意义。

近年来，随着中药材的全球需求量增加，中药材的质量标准及对其外源性有害物质的相关检测越来越受到国家和有关部门的重视。《中华人民共和国　药典》2020版增加了第五法[4]，同时列出禁用农药清单，采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法测定的农药残留增加到91种，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定的农药残留扩充到526种。目前，中药材中农药残留的常见检测方法有气相色谱法[5]、气相色谱-串联质谱法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]。然而，不同中药材供试品溶液的基质存在较大差异，其成分相对复杂，因此样品处理技术及农药残留的提取是中药材农药残留定量分析的技术难点[8]。QuEChERS是一种操作快速、简单、高效、低成本的样本制备，该法集样品萃取及基质净化于一身，具有优越的高效性、准确性和重复性，被广泛用于中药材农药残留的前处理过程中[9-13]。快速滤过型净化(m-PFC)法是基于QuEChERS原则开发的一种新型快速样品前处理净化柱，将N-丙基乙二胺(PSA)、多壁碳纳米管(MWCNTs)和十八烷基键合硅胶(C18)装入注射器中制成，通过吸取提取液再推送出去的方式，使提取液中色素、有机酸、脂肪、糖类等物质与填料层相互作用，而目标化合物不被吸附，从而实现净化。该方法可实现一步法净化，从而大大缩短净化时间，提高处理速度和效率，已用于食品药品农药残留检测中[14-17]。

笔者根据目标化合物的种类及性质，采用基于m-PFC净化法，参考《中华人民共和国药典》2020年版四部通则关于农药残留检测的相关要求，建立了杏花中55种农药残留的GC-MS/MS筛查及定量分析的方法。该方法高效、便捷、通量高、准确度好，满足检测要求，为中药材农药残留样品前处理及大通量检测提供了可行性依据。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱质谱联用仪：GCMS-TQ8040型，日本岛津公司。高速冷冻离心机：3-18KS型，上海希格玛高技术有限公司。多管涡旋混合器：2500MT型，上海力辰邦西仪器科技有限公司。高速万能粉碎机：FW-80型，北京市永光明医疗仪器有限公司。乙腈：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。m-PFC快速滤过净化柱：（1）简单基质为150 mg MgSO4、15 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和15 mg 多壁碳纳米管（MWCNTs）；（2）复杂基质为150 mg MgSO4、15 mg PSA和25 mg MWCNTs，北京绿绵科技有限公司。乙酸缓冲盐体系盐包：含有6 g MgSO4和1.5 g乙酸钠，日本岛津公司。氯化钠缓冲盐体系盐包：含有4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠，日本岛津公司。55种农药标准物质：质量浓度均为100 μg/mL，日本岛津公司。55种农药混合标准储备液：质量浓度均为10 μg/mL，取适量55种农药标准物质，用乙腈配制而成，密封后，避光储存于4 ℃冰箱中。杏花样品：来自10个不同产地的10批样品，由河北省药品检验研究院专家鉴定。其中7批为市售，产地分别为安徽、河南、江苏、陕西蓝田、山西、陕西旬邑、浙江，批号分别为XH001、XH004、XH005、XH006、XH007、XH008和XH010，3批为自采山杏花样品(阴干)，产地分别为北京房山、张家口沽源县、张家口鱼儿山，批号分别为XH002、XH003和XH009。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱色谱柱：SH-Rtx-5SilMS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本岛津公司)，进样口温度：280 ℃；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氩气，纯度(体积分数)不小于99.999%；柱流量：1.0 mL/min；进样方式：分流进样，分流比为3∶1；程序升温：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，以10 ℃/min升至300 ℃，保持15 min。1.2.2 质谱接口温度：280 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：200 ℃；检测器电压：0.7 kV；测定方式：多反应监测(MRM)模式；进样体积：1 μL；55种化合物保留时间及质谱检测参数见表1。

 

表1   55种化合物保留时间及质谱检测参数Tab. 1   Mass spectrum parameter of 55 strobilurin fungicide

 

1.3 实验步骤

1.3.1 样品制备取杏花样品于高速万能粉碎机中粉碎后，过3号筛(孔径为355 μm)，装入样品袋，标记，密封备用。1.3.2 样品处理准确称取样品2.0 g，置于50 mL塑料离心管中，加10 mL水，涡旋混匀，静置30 min。加入15 mL 1%乙酸乙腈溶液，再加入乙酸缓冲盐体系盐包及陶瓷均质子，旋涡混匀1 min，于25 ℃超声提取10 min，以5 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液，移入m-PFC小柱上端，缓慢推动注射杆，过0.22 μm有机滤膜，作为样品溶液。1.3.3 定量方法精密称取7份2.0 g杏花空白基质(自种阴性空白杏花样品，无农药添加，经阴干后粉碎制成)于50 mL塑料离心管中，分别加入22.5、75、150、300、750、900、1 500 μL各组分质量浓度均为10 μg/mL的55种农药混合标准储备液，同1.3.2方法提取及净化，续滤液过0.22 μm有机滤膜，得质量浓度均分别为15、50、100、200、500、600、1 000 ng/mL基质系列混合标准工作溶液，上机分析。将基质系列混合标准工作溶液和样品溶液依次注入气相色谱-质谱联用仪中，以保留时间和定性离子定性，测得定量离子色谱峰面积，以农药标准溶液质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，样品溶液中农药响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内。

 

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

根据《中华人民共和国药典》检测和我国常用农药种类，选择了55种适合GC-MS/MS分析的农药作为目标分析化合物，包含有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯类、三唑类和酰胺类农药。因其种类多且极性存在较大差异，故而选择合适的提取溶剂显得尤其重要。常用的QuEChERS净化包分为两大类，一类用乙腈配合氯化钠柠檬酸钠缓冲体系盐包，一类用乙酸乙腈配合乙酸钠缓冲体系盐包。考察了使用乙腈、甲醇、1%乙酸乙腈、1%乙酸甲醇与上述两种盐包体系的不同组合，结果发现，当样品中加入乙酸乙腈和乙酸钠缓冲体系后，基质pH值整体维持在5.0～6.0，该体系能有效防止有机磷类和菊酯类等对酸碱敏感的农药的降解，并能提取出大部分农药残留，使其回收率保持在70%～120%。

2.2 净化条件的选择

杏花样品中含色素、糖类和有机酸等物质[18]，为农药多残留检测带来挑战。同时杏花样品中农药残留量往往不是很高，所含物质会对测定结果产生影响，且有较强的基质效应，故选择合适处理方法不仅可对杏花样品中农药残留的提取测定起到重要作用，还能有效减少杂质对分析仪器的污染和损坏。常见的QuEChERS净化包中起主要作用的是PSA、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)和石墨化炭黑(GCB)。其中，PSA可有效除去极性有机酸及一些糖类和脂类物质；C18起到非极性物理吸附作用，可除去脂类和固醇类物质；GCB能对色素及一些小分子干扰物质起到较好的吸附作用，但其平面六边形结构会对一些平面结构目标物有较强吸收，导致回收率偏低。m-PFC在传统QuEChERS净化包基础上优化，在填料中添加MWCNTS，该材料具有更大比表面积，分散性更好，能够更好地去除基质中色素、有机酸、部分糖类、甾醇类等干扰物质。当添加水平为80 μg/kg时，分别用m-PFC快速滤过净化柱和QuEChERS净化包净化，杏花中55种农药在不同净化方法下加标回收率见表2。由表2可知，用m-PFC快速滤过净化柱净化后回收率为70%～120%的农药数量明显大于QuEChERS净化包净化。

 

表2   杏花中55种农药在不同净化方法下的加标回收率

Tab. 2   The spiked recovery rates of 55 pesticides in apricot blossoms under different purification methods

回收率/%	农药数量
	QuEChERS 净化包	m-PFC (简单基质)	m-PFC (复杂基质)
<70	6	2	0
70~120	48	49	52
>120	1	4	3

 

考察m-PFC快速滤过净化柱复杂基质与简单基质净化效果，发现使用m-PFC快速滤过净化柱复杂基质把MWCNTS填料增加到25 mg，与使用简单基质净化柱相比较，脱叶磷与吡丙醚回收率从67%涨到约80%，三硫磷从125%降到约110%，氯氰菊酯、溴氰菊酯、特丁硫磷等30余种从72%~83%涨到83%~95%。采用m-PFC柱净化方法，可以有效净化样品，处理10批样品时间从40 min缩短到15 min，故用m-PFC快速滤过净化柱（复杂基质）净化方法。在电子轰击源（EI）模式下以正构烷烃确定55种目标化合物的保留指数，确定保留时间，参考数据库分别找到各化合物的定量离子对和定性离子对。在优化后的气相色谱-质谱条件下所采集的55种目标化合物多反应监测模式（MRM）质谱图如图1所示。

 

图1   55种农药标准物质多反应监测质谱图

Fig. 1   Multi reaction monitoring mass spectrometry of 55 pesticide reference materials

 

2.3 基质效应影响

采用气相色谱-质谱法测定农药残留时，由于目标化合物在由热的进样口进入色谱柱的过程中有基质会参与，进而减少了不稳定化合物的分解，或者由于基质使进样口活性位点被屏蔽，从而减少了极性目标化合物被活性位点吸附，进而影响分析结果的重现性和稳定性[19]。采用提取后加入法和绝对基质响应法来评价基质效应[20]，通过测定各目标化合物在基质匹配校准溶液中的斜率Km及其在溶剂校准曲线中的斜率K采用公式：

 

 

当0 ＜ EM ≤ 20%时为弱基质效应，当20% ＜ EM ≤ 50%时为中等基质效应，当EM ＞ 50%时，为强基质效应。考察了各目标化合物在杏花样品中的基质效应，结果发现甲胺磷、乙酰甲胺磷、久效磷、噻唑磷、胺菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、噁唑磷、乐果的EM均大于50%，均为强基质效应；灭线磷、敌敌畏、速灭磷、地虫硫磷、三唑磷、虫螨磷、倍硫磷的EM均不超过20%，均为弱基质效应；其余化合物均为中等基质效应，因此采用空白基质溶液配制校准曲线进行定量分析，以此来抵消基质效应的影响，使定量结果更加准确。

2.5 线性方程、检出限和定量限

在1.2仪器工作条件下，对基质系列标准工作溶液进行测定，以各农药质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。以信噪比(S/N)约为3和10时的空白样品添加浓度分别作为方法检出限和定量限。各化合物线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。由表3可知，55种农药在各自浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.990～0.999 5，检出限为3.75～15 μg/kg，定量限为10～45 μg/kg。依据《中华人民共和国药典》2020年版四部规定，该方法满足要求。

 

表3   杏花中55种农药的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 3   Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs，LOQs of the 55 pesticides in the prunus apricot flower samples

 

2.5 回收率和精密度试验

在杏花阴性样品中添加55种化合物混合标准溶液，添加水平分别为40、90、200 μg/kg，在优化的仪器工作条件下测定，每个添加水平平行测定6次，试验结果见表4。由表4可知，在3个添加水平下，各化合物平均加标回收率分别为74.6%~114.1%、75.3%~109.1%、81.5%~112.6%，测定结果的平均相对标准偏差分别为1.2%~9.3%、1.3%~9.4%、0.7%~9.4%，表明该法准确度和精密度满足测定要求。

 

表4   加标回收与精密度试验结果(n=6)

Tab. 4   Results of standard addition recovery and precision test

 

3 结语

建立了基于m-PFC快速滤过净化柱净化，采用GC-MS/MS检测杏花中55种农药残留的分析方法。m-PFC快速滤过净化柱净化较传统QuEChERS处理方法，操作简便高效，灵敏度高、重现性好，能更有效的降低复杂基质的干扰，适用于杏花中55种农药残留的检测。该方法对杏花中农药残留具有一定价值，可为《中华人民共和国药典》2020年版四部中规定的农药残留及其他中药材饮片或颗粒中农药残留提供技术参考，保证我国中药材质量安全。

 

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关键词： 快速滤过型净化结合气相色谱-串联质谱法 杏花