最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）是常常被用于衡量抗菌药物的研发和药敏试验的重要指标。通常地最小抑菌浓度（MIC）是指抗菌药物抑制细菌生长的最低药物浓度；最小杀菌浓度（MBC）是指抗菌药物杀死99%以上细菌的最低药物浓度。

 

而对于这两种浓度，通常是先测定最小抑菌浓度（MIC），然后基于MIC结果测定最小杀菌浓度（MBC）。下面是分享测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的主要实验步骤和注意事项：

 

2.实验步骤

2.1 准备工作

（1）培养基准备：Middle Brook 7H9肉汤培养基（分枝杆菌）、Middle brook 7H10固体培养基、蒸馏水等

（2）试剂、耗材准备：96孔板、细菌培养皿、试管、锥形瓶、接种环、酒精灯、打火机、高压蒸汽灭菌锅、37℃恒温培养箱、生物安全柜、超净工作台、恒温摇床、移液枪、10/200/1000μL tip头、酒精或DMSO、麦氏比浊管、0.22μm过滤器等

（3）菌液制备：配置Middle Brook 7H9肉汤培养基、Middle brook 7H10固体培养基使用高压蒸汽灭菌法121℃、30min进行灭菌处理。

2.2 实验步骤

（1）将准备的细菌培养皿、试管、锥形瓶、接种环、酒精灯等物品放置在超净工作台打开紫外线照射至少30min。

（2）取涂布的平板或是保存在-80℃的菌种在倒好平板上划线，正置在恒温培养箱中30min左右后，倒置培养。

（3）待划线的平板长出单克隆菌落，使用接种环挑取单个菌落，置于液体培养基中培养，通过测定OD600值调整至对数期。

（4）使用麦氏比浊管调整菌液浓度，一般地0.5麦氏浊度标准液大概菌数目约为1.5×108CFU/mL(图1)，稀释至1×106CFU/mL。

图1 麦氏比浊管标准管近似浓度（引自https://www.bikeman-bio.com/chanpinzhanshi/8002.html）

（5）稀释抗菌药物（以异烟肼、利福平抗分枝杆菌为例）：在超净工作台以无菌的96孔板为药物浓度梯度稀释的容器，在96孔板上做好标记，首先在第一孔加入100μL药物母液，后续剩余孔加入50μL液体培养基，然后从第一孔吸取50μL母液至第二孔，混匀后依次进行，最终形成药物的浓度梯度。

（6）接着，接种菌液按照50μL/孔依次加入96孔板，其中菌浓度大约为5×105CFU/mL。

（7）设置阴性对照组（液体培养基+菌液）、阳性对照组（液体培养基）。

（8）培养：置于恒温培养箱中培养并观察菌的生长状态。

（9）分析：根据定义通过肉眼观察，其中使细菌无明显生长的药物浓度即为最低药物浓度为MIC。

（10）测定MBC：基于MIC，我们选取包括最低药物浓度MIC孔在内的更高药物浓度的孔，吸取10~20μL，滴加在固体培养基琼脂板上，使用涂布棒将其涂匀。

（11）将固体琼脂板置于恒温培养箱培养并观察菌的生长状态。

（12）分析：根据定义，我们通过技术琼脂板上的单克隆菌落，寻找与接种菌量相比，生长的菌落数减少量≥99.9%的平板对应孔的药物浓度即为最低药物浓度MBC。

 

3. 注意事项

（1）操作过程中，要保证无菌操作，避免杂菌影响；全程要穿好实验服、佩戴好手套、口罩。

（2）通常地，溶解抗菌药物通常使用DMSO、乙醇等无菌溶剂，并过滤除菌后使用。

（3）使用麦氏比浊管的主观性比较强，因此要充分摇匀麦氏比浊管后使用。

（4）对琼脂板进行涂布和划线时需要注意力度，要避免划破琼脂板。

（5）要注意设置重复组（通常3个），包括孔板药物浓度设置，琼脂板单克隆菌落计数。

（6）对稀释的药物浓度做好标记，避免混淆。