摘 要： 建立蒽酮-硫酸分光光度法测定牛血浆试验液中的菊粉。在含有菊粉的血浆样品中加入三氯乙酸除蛋白，以3 000 r/min转速离心，取上清液过滤后进行测定。测定波长为627 nm，蒽酮试剂用量为样品溶液体积的10倍，于60 ℃水浴中显色反应10 min，样品溶液稀释至4倍体积。菊粉质量浓度在25～150 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 4，检出限为1.49 mg/L。样品加标回收率为98.12%～101.53%，测定结果的相对标准偏差为0.74%（n=5）。该方法操作简单，适用于血浆试验液中菊粉的测定。

 

关键词： 菊粉； 血浆试验液； 蒽酮-硫酸分光光度法

 

菊粉又称菊糖，主要来源于植物，是一种多糖聚合物，其相对分子质量从几百到几千不等，广泛应用于食品和医药领域[1‒2]。菊粉在医药领域可用作肾功能诊断剂[3‒4]，菊粉的筛选系数主要用于评估高通量透析器对中分子物质的清除能力。筛选系数是通过透析器滤出液溶质浓度与透析器血液入口溶质浓度及血液出口溶质浓度计算而得，因此需要检测试验液中菊粉的浓度。目前菊粉的检测主要是针对农作物中的菊粉，检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、离子色谱法等[5‒7]。分光光度法有3，5-二硝基水杨酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[8‒9]，高效液相色谱法[10‒11]和离子色谱法[12‒13]多数需要将菊粉通过强酸或者菊粉酶水解后进行测定，且色谱法对仪器设备以及样品处理的要求较高。

 

现行医疗器械行业标准YY 0053—2016《血液透析及相关治疗　血液透析器、血液透析滤过器、血液滤过器和血液浓缩器》中规定了菊粉的筛选系数应符合生产企业的规定，其首选试验液为抗凝牛血浆或者抗凝牛全血。有研究报道采用酶联免疫法测定动物血清或尿液中的菊粉质量浓度[14]，但关于血浆试验液中菊粉质量浓度检测方法的研究报道很少，有文献报道采用微量比色法测定动物血浆中的菊粉质量浓度[15]，但该方法操作步骤繁琐、试剂用量多，不利于进行批量试验。笔者用三氯乙酸[16‒17]对牛血浆样品进行预处理，除去血浆中的蛋白质，采用蒽酮硫酸法测定其中的菊粉质量浓度。该方法操作简单、快速、试剂用量较少、准确性好，为血浆中菊粉质量浓度的测定提供了有效的检测手段。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

紫外可见分光光度计：Lambda 365型，美国珀金埃尔默股份有限公司。

低速台式离心机：TDL-5-A型，上海安亭科学仪器厂。

电子天平：SECURA224-1CN型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯集团。

纯水机：Synergy UV型，美国默克密理博有限公司。

涡旋混匀器：Vortex 3型，艾卡(广州)仪器设备有限公司。

菊糖：生化试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

三氯乙酸、蒽酮：均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

硫酸：分析纯，广州化学试剂厂。

抗凝牛血浆：抗凝剂为柠檬酸钠，广州蕊特生物科技有限公司。

1.2 样品处理

在抗凝牛血浆中加入一定量的菊粉(菊粉质量浓度为300～400 mg/L)，充分搅拌溶解后作为透析器筛选系数试验液，分别取透析器血液入口端、血液出口端、滤出液端的溶液作为样品检验液。在样品检验液中加入等体积的三氯乙酸溶液(1.2 mol/L，下同)，涡旋混匀，沉淀后离心30 min (转速为3 000 r/min)，取上清液并过滤，滤液作为样品待测液，此时样品待测液中菊粉质量浓度为150～200 mg/L)，置于4 ℃保存。

1.3 溶液配制

菊粉储备液：1 000 mg/L，精密称取1 g菊糖，用纯水溶解后转移至1 000 mL容量瓶中，用纯水定容至标线，混匀。蒽酮试剂：精密称取蒽酮0.28 g，溶于40 mL水与100 mL硫酸的混合液中，避光保存。菊粉系列工作溶液：将菊粉储备液用水稀释，配制成质量浓度分别为50、100、150、200、250、300 mg/L的系列溶液，在系列溶液中分别加入等体积的三氯乙酸溶液，得到质量浓度分别为25、50、75、100、125、150 mg/L的菊粉系列工作溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 方法原理

样品检验液中的多糖在硫酸作用下脱水生成糠醛，与蒽酮缩合成蓝绿色糠醛衍生物，该物质在一定浓度范围内，其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比[18]。利用反应产物吸光度与糖浓度间的线性关系，实现对菊粉质量浓度的定量测定。

1.4.2 样品测定

以三氯乙酸水溶液(三氯乙酸溶液与纯水体积比为1∶1)作空白参比，取200 μL菊粉系列溶液，分别加入2 mL蒽酮试剂，涡旋混匀后置于60 ℃水浴中反应10 min，迅速冷却至室温，在627 nm波长下依次测定菊粉系列工作溶液的吸光度，以溶液中菊粉质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。取100 μL 经1.2处理后的样品待测液，加入100 μL纯水，混匀后加入2 mL蒽酮试剂，涡旋混匀，置于60 ℃水浴中反应10 min，迅速冷却至室温，在627 nm波长下测定吸光度，用标准曲线法计算样品中菊粉的质量浓度。

 

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的选择

不含三氯乙酸的菊粉溶液和含有三氯乙酸的菊粉溶液在可见光区的吸收光谱如图1所示。

图1   菊粉溶液的紫外-可见吸收光谱图

Fig. 1   UV-VIS absorption spectra of inulin solutions

由图1可以看出，不含三氯乙酸和含有三氯乙酸的菊粉溶液均在627 nm波长附近出现最大吸收峰，这与蒽酮-硫酸法测定水溶液中多糖含量的检测吸收波长在620 nm左右的研究结果相符[18‒19]，表明三氯乙酸对菊粉溶液显色反应产物的吸收波长无明显影响，对吸光度影响也较小，因此，选择检测波长为627 nm。

2.2 蒽酮试剂用量的确定

取250 mg/L的菊粉溶液100 μL，加入三氯乙酸溶液100 μL，分别加入蒽酮试剂1、2、4 mL (蒽酮试剂与测试液的体积比分别为5∶1、10∶1、20∶1)，涡旋混匀，其中加入1 mL蒽酮试剂的菊粉溶液出现浑浊，其余菊粉溶液按照1.4.2实验方法显色反应10 min后，加入2 mL蒽酮试剂的菊粉溶液呈较深的蓝绿色，加入4 mL蒽酮试剂的菊粉溶液呈很深的蓝绿色。在627 nm处测定吸光度，加入2 mL蒽酮试剂的菊粉溶液吸光度接近1.0，加入4 mL蒽酮试剂的菊粉溶液吸光度接近2.0。吸光度值过大可能会出现偏离朗伯-比尔定律的情况，测量误差会增大，因此选择蒽酮试剂的加入体积为2 mL，即蒽酮试剂的体积与测试液的体积比为10∶1。

2.3 显色反应时间的确定

取250 mg/L的菊粉溶液100 μL加入100 μL三氯乙酸溶液，加入蒽酮试剂2 mL，涡旋混匀，于60 ℃水浴中分别显色反应5、8、10、15、20 min，迅速冷却至室温，在627 nm波长下分别平行测定3次吸光度，结果如图2所示。由图2可以看出，菊粉溶液的吸光度随着反应时间的增加呈现出先增大后减小的趋势，反应时间在10 min和15 min时吸光度差别不大，10 min时吸光度最大，因此选择显色反应时间为10 min。

图2   菊粉溶液在不同显色反应时间时的吸光度

Fig. 2   The absorbance of inulin solutions at different staining reaction times

2.4 测试液稀释比例的选择

取1.2中的样品待测液100 μL，分别加入0、50、100、150、200 μL纯水(相当于样品溶液分别稀释至2、3、4、5、6倍体积)，对应加入10倍体积的蒽酮试剂，按照1.4.2中实验方法显色反应10 min，迅速冷却至室温后，在627 nm波长下分别平行测定3次吸光度，以平均值作为测定值，结果如图3所示。由图3可以看出，随着样品溶液稀释倍数的增大，溶液吸光度逐渐减小。根据实际样品的菊粉质量浓度和标准曲线的最大浓度点，选择吸光度在0.8左右为宜，因此确定将测试液稀释至4倍体积。

图3   菊粉溶液不同稀释倍数时的吸光度

Fig. 3   The absorbance of inulin solutions at different dilution ratios

2.5 线性方程与检出限

按照1.4.2方法测定菊粉系列溶液的吸光度，以溶液中菊粉质量浓度(ρ)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线，得标准曲线方程为A=0.006 2ρ-0.015 7，相关系数为0.999 4，表明菊粉的质量浓度在25～150 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系。在相同测试条件下，重复测定空白溶液20次，得到吸光度的标准偏差为0.003 07。根据国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)的规定，检出限为空白值的3倍标准差与标准曲线的斜率之比，计算得该方法的检出限为1.49 mg/L。

2.6 精密度试验

取菊粉筛选系数检验液，按照1.2方法处理，得到的样品待测液按照1.4.2测定吸光度，平行测定5次，精密度试验结果见表1所示。由表1可知，测定结果的相对标准偏差为0.74%，表明该方法具有良好的精密度。

表1   精密度试验结果

Tab. 1   Results of precision test

 

2.7 稳定性试验

取菊粉筛选系数检验液按照1.2方法处理，得到的样品待测液按照1.4.2方法进行显色反应，冷却至室温，分别于第0、5、10、20、30、60、120 min测定吸光度，稳定性试验结果见表2。由表2可知，测定结果的相对标准偏差为1.28%，表明样品待测液在120 min内稳定性良好。

表2   稳定性试验结果

Tab. 2   Results of stability test

 

2.8 样品加标回收试验

取菊粉筛选系数检验液按照1.2方法处理，取7份处理后的样品待测液，1份用于测定本底值，其余6份各加入50 mg/L含有三氯乙酸的菊粉溶液，按照1.4.2方法进行处理和测定，计算加标回收率，结果见表3。由表3可知，菊粉的加标回收率为98.12%～101.53%，平均回收率为99.55%，表明该方法测定血浆试验液中的菊粉质量浓度具有良好的准确性。

表3   样品加标回收试验结果

Tab. 3   Results of samples spiked recovery rate

 

3 结论

(1) 采用蒽酮-硫酸分光光度法建立了牛血浆试验液中菊粉质量浓度的测定方法，分别对显色剂用量、测试液稀释比例、显色时间等检测条件进行了优化，确定了最佳测定波长为627 nm，选用显色剂与测试液的体积比为10∶1，显色时间为10 min，样品测试液稀释至4倍体积。

(2) 该方法使用的显色剂用量较少、测定样品需求量少、反应时间较短，在不影响检测准确性的同时减少了检测成本，检测过程操作简便快捷、对硬件要求低、精密度高，可用于血浆试验液中菊粉的测定。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 蒽酮-硫酸分光光度法 血浆试验液 菊粉