摘 要： 建立高效液相色谱-串联质谱测定暗示减肥的饮料和蜜饯中10 种利尿剂类兴奋剂含量的方法。样品经乙酸乙酯超声提取，HLB固相萃取柱净化，使用Acclaim RSLC 120 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）分离，甲醇和5 mmol/L乙酸铵溶液为液相流动相，梯度洗脱，在电喷雾离子源（ESI）负离子模式下电离，多反应监测（MRM）扫描下进行定性和定量分析。结果表明，10 种利尿剂类兴奋剂的质量浓度在1～100 ng/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.999，饮料、蜜饯中的检出限均为1.0 μg/kg，定量限均为2.0 μg/kg。在低、中、高3个浓度水平加标下方法回收率为65.5%～105.4%，测定结果的相对标准偏差为1.1%～8.7%（n=6）。该方法适用于减肥类饮料和蜜饯中利尿剂类兴奋剂的精准检测。

 

关键词： 饮料； 蜜饯； 利尿类兴奋剂； 固相萃取； 高效液相色谱-串联质谱法

 

随着人们生活水平的提高和对瘦身的需求，各种暗示减肥的功能性饮料或者糖果蜜饯受到年轻消费者的青睐。而非法添加利尿类兴奋物质使体内代谢加快，可达到瘦身效果，一些不良商家为谋取利益，在宣称或者暗示减肥类食品中添加利尿类兴奋物质［1］。利尿剂是具有利尿减肥、降压等治疗作用，通过增加电解质和促进水排出的一种药物［2］，因此在需要快速减肥达到某一目标，或通过增加尿量快速排出体内其他兴奋剂而滥用，故不同种类利尿剂在国际奥委会禁用，被世界反兴奋剂机构（WADA）列入禁止使用的兴奋剂清单［3-4］。

 

目前关于利尿类兴奋剂检测方法有薄层色谱法［5］、表面增强拉曼光谱法［6］、高效液相色谱法［7］、高效液相色谱-质谱法［8］、气相色谱-质谱法［9］等。薄层色谱法灵敏度低，易受污染；高效液相色谱法存在假阳性，需要质谱法进一步确证；表面增强拉曼光谱法需要特定的增强试剂基底，定量重复性差；气相色谱-质谱法样品处理操作繁琐，需要衍生化；高效液相色谱-质谱法选择性好、灵敏度高，是目前应用较为广泛的方法。虽然关于利尿类兴奋剂的方法有很多，但检测对象主要是动物源食品［10］、膳食补充剂［11］、保健食品［1］、饲料［12］、血浆［13］、尿液［14］等，而在常见的暗示减肥类的饮料和蜜饯中的检测应用未见报道。

 

笔者针对网售火爆的饮料、蜜饯等暗示减肥类食品，结合固相萃取净化，采用高效液相色谱-质谱法分析，建立一种快速同时检测氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、甲氯噻嗪、氢氟噻嗪、乙酰唑胺、环戊噻嗪、依他尼酸10种利尿类兴奋剂的方法，为减肥食品中利尿类兴奋剂的检测提供一种新的研究思路，完善标准体系，助力高效监管。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-三重四级杆质谱仪：QTRAP 4500型，美国赛克斯公司。

电子分析天平：BSA224s型，感量为0.1 mg，北京赛多利斯科学仪器有限公司。

高速离心机：Multifuge X1R型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

超声波仪：BK-900C型，济宁丰鑫超声设备有限公司。

多通道样品浓缩仪：M64型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、甲氯噻嗪、氢氟噻嗪、乙酰唑胺、环戊噻嗪、依他尼酸标准品：质量分数均大于98.0%，CAS号分别为58-94-6、58-93-5、77-36-1、54-31-9、73-48-3、135-07-9、135-09-1、59-66-5、742-20-1、58-54-8，中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈、甲酸：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。

乙酸乙酯：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

乙酸铵：分析纯，上海安谱科学仪器有限公司。

PriME HLB固相萃取柱：规格为200 mg（6 mL），美国沃特世科技有限公司。

C18固相萃取柱：规格为200 mg（6 mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

QuEChERS净化柱：内容物为100 mg MgSO4、50 mg PSA和100 mg C18（2 mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

实验用水：经净化系统过滤的超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Acclaim RSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm， 2.2 μm，美国戴安公司）；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为甲醇，B相为5 mmol/L乙酸铵溶液，流量为0.3 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度淋洗程序

Tab. 1   Gradient washing program

 

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源（ESI）；电离方式：负离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）扫描；离子化电压：4 500 V；气帘气压力：200 kPa；雾化压力：380 kPa；辅助气压力：380 kPa；离子源温度：400 ℃；优化10种利尿类兴奋剂碰撞能量、去簇电压见表2。

表2   10种利尿类兴奋剂的质谱参数

Tab. 2   Mass spectrometry parameters of 10 diuretic stimulants

注：*为定量离子。

 

1.3 标准溶液配制

混合标准储备液：分别称取10 mg（精确至0.1 mg）氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、甲氯噻嗪、氢氟噻嗪、乙酰唑胺、环戊噻嗪、依他尼酸标准品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至标线，配制成各组分质量浓度均为1.0 mg/mL混合标准储备液，于-20 ℃保存。

系列混合标准工作溶液：在实验过程中根据需要将标准混合储备液用甲醇逐级稀释配制成10种利尿类兴奋剂质量浓度均分别为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列混合标准工作溶液，临用现配。

1.4 样品处理

精密称取样品2 g（精确至0.1 mg）至50 mL离心管中，加入10 mL 1 %（体积分数）氨水乙酸乙酯，振荡均匀后超声提取20 min，以9 000 r/min离心5 min，重复提取1次，合并上清液，取2 mL上清液经HLB固相萃取净化，高速离心，上清液以45 ℃氮吹至近干，残渣用1.0 mL初始流动相（A与B体积比为2∶98）溶解，过有机滤膜，上机测定。

1.5 数据处理

使用AB Sciex Analyst 分析软件对采集的数据建立线性方程，并对样品进行外标法定量分析。

 

2 结果与讨论

2.1 流动相的优化

分别考察有机相为甲醇与乙腈，水相为水、乙酸铵溶液（5 mmol/L）对10种利尿类兴奋剂的影响，结果表明，有机相为甲醇和乙腈时，10种利尿类兴奋剂均具有较高的响应值和分离度，但是有机相为甲醇时，氯噻酮、依他尼酸的响应值是乙腈的2倍，因此有机相最终选择甲醇；当水相分别为水、乙酸铵溶液时，10种利尿类兴奋剂均能有效分离，但水相为水溶液时，氯噻酮、甲氯噻嗪和环戊噻嗪半峰宽大，加入乙酸铵有利于改善色谱峰形，因此水相最终选择乙酸铵溶液（5 mmol/L）。

2.2 质谱条件优化

在针泵恒流进样的方式直接注入各组分质量浓度均为0.2 μg/mL（按1.3方法临用现配）的10种利尿类兴奋剂混合标准溶液于质谱仪中，分别对10种兴奋剂进行质谱参数优化。结果表明，10种兴奋剂在ESI-模式下均具有最高响应度，因此选择负离子扫描模式，通过调整去簇电压的大小，确定各化合物响应值最高的两个离子对，分别为定量离子对和定性离子对，再优化其他质谱参数。10种利尿类兴奋剂采集的保留时间及质谱参数见表2。

2.3 提取溶剂的优化

考察了常见的甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%氨水-乙酸乙酯作为提取溶剂对10种利尿类兴奋剂的提取回收率的影响。不同提取溶剂下，饮料和蜜饯样品中10种利尿类兴奋剂的提取回收率分别见图1和图2。从图1、图2可以看出，乙酸乙酯较乙腈的提取效率高，甲醇的提取效率较低，1%氨水乙酸乙酯提取时，能提高苄氟噻嗪、甲氯噻嗪的回收率，但有明显沉淀色素的现象，其中依他尼酸、呋塞米、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、氢氟噻嗪物质沉淀在下层氨水中，回收率约为50%，因此采用乙酸乙酯作为提取溶剂。

图1   饮料中10种利尿类兴奋剂的回收率

Fig. 1   Recovery rates of 10 diuretic stimulants in beverages

图2   蜜饯中10种利尿类兴奋剂的回收率

Fig. 2   Recovery rates of 10 diuretic stimulants in candied fruits

2.4 净化方式的优化

比较了3种净化方式对10种利尿类兴奋剂回收率的影响。结果表明，C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱、QuEChERS净化管对饮料和蜜饯样品均具有较好的净化效果，但是不同净化方式对10种利尿类兴奋剂的回收率差别明显［1, 9］。其中，C18固相萃取柱对氢氯噻嗪不保留，回收率小于50%；HLB固相萃取柱、QuEChERS净化管对10种利尿类兴奋剂的回收率均大于80%。此外，在蜜饯基质中，氯噻嗪、呋塞米经HLB固相萃取柱净化后的回收率高于QuEChERS净化管；在饮料基质中，QuEChERS净化管的回收率和HLB固相萃取柱相差不大。综合考虑，选择HLB固相萃取柱作为该方法的净化方式。

2.5 基质效应的评价

基质效应是色谱分析过程中样品共洗脱物质对目标物的离子化效应的影响，会抑制或增强目标物的响应强度［11］。采用基质溶液配制的标准曲线斜率与溶剂配制的标准曲线斜率的比值来评价基质效应，当斜率比值在0.85~1.15之间，则认为不存在基质效应［15］。分别对饮料和蜜饯两种样品做基质效应评价，10种利尿类兴奋剂的基质效应结果数据见表3。由表3可知，饮料中10种利尿类兴奋剂的基质效应为0.78~1.18，基质效应不明显；蜜饯中10种利尿类兴奋剂的基质效应为0.58～1.65，基质效应明显，故蜜饯样品检出阳性时，可采用基质标准溶液进行校正。

表3   饮料和蜜饯中10种利尿类兴奋剂的基质效应

Tab. 3   Matrix effects of 10 diuretic stimulants in beverages and candied fruits

 

2.6 线性方程、线性关系及检出限、定量限

在1.2仪器工作条件下，分别对各组分质量浓度为1～100 ng/mL的系列混合标准工作溶液进行测定，建立10种利尿类兴奋剂的色谱峰面积与其质量浓度的线性回归方程，用阴性样品进行加标回收试验，定量添加混合标准工作溶液，分别以信噪比为3和10确定方法检出限和定量限。10种利尿类兴奋剂的线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限及定量限见表4。由表4可知，10种利尿类兴奋剂的质量浓度在1~100 ng/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均不小于0.999，饮料、蜜饯中的检出限均为1.0 μg/kg，定量限均为2.0 μg/kg。

表4   10种利尿类兴奋剂的线性方程、相关系数及检出限、定量限

Tab. 4   Linear regression equations， correlation coefficients and LODs，LOQs of ten diuretic stimulants

 

2.7 精密度与回收率

选取饮料、蜜饯阴性样品进行加标回收试验，分别添加2.0、4.0、20.0 μg/kg低、中、高3种不同质量浓度的混合标准溶液，按照1.4方法处理，做平行样6份，在1.2仪器工作条件下进行分析，计算平均回收率和测定结果的相对标准偏差，试验结果见表5。由表5可知，10种利尿类兴奋剂的平均回收率为65.5%~105.4%，测定结果的相对标准偏差（RSD）为1.1%~8.7%。其中在饮料中，10种利尿类兴奋剂的加标平均回收率为68.5%~105.4%，RSD为1.6%~6.7%；在蜜饯中，10种利尿类兴奋剂加标平均回收率为65.5%~103.7%，RSD为1.1%~8.7%，表明该方法具备较高的准确度和良好的精密度，能满足饮料、蜜饯中10种利尿类兴奋剂的检测要求。

表5   10种利尿类兴奋剂的加标回收率及RSD（n=6）

Tab. 5   Recoveries and RSDs of ten diuretic stimulants for spiked samples（n=6）

 

3 结语

建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮料和蜜饯中10种利尿类兴奋剂。通过优化仪器工作条件、提取试剂和净化工艺，样品采用乙酸乙酯提取，固相萃取净化，实现了饮料和蜜饯基质中多种利尿剂类兴奋剂的测定分析。相比其他方法，该方法具有操作简单、检测通量大、稳定性好、适用性强等优点，不仅扩充了可检测的利尿类兴奋剂种类，也为食品中非法添加物的筛查与监控提供技术支持。需要注意的是，检测和验证的基质有限，仅限饮料和蜜饯类，市场还存在其他大量宣称减肥的保健食品和普通食品，后续将继续对其他食品类别进行验证。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法 饮料 蜜饯 利尿类兴奋剂