一、细胞毒性

细胞毒性试验是利用细胞培养技术，确定由器械、材料和（或）其浸提液引起的细胞溶解（细胞死亡），细胞生长抑制，克隆形成和其他细胞方面的影响。常根据ISO 10993-5/GB/T 16886.5进行测试。

医疗器械细胞毒性试验凭借其操作简便、周期短、灵敏度高、性价比高等特点，成为了最常用的生物相容性测试之一，常用于评价医疗器械中是否含有可能危害人体健康的物质存在。

 

二、细胞毒性试验的特点及解决方案

随着这些年医疗器械的大力发展，特别是创新类材料器械的不断涌现，在国产器械加速替代的同时，也越来越多的出现细胞毒性测试不合格的情况。遇到这些情况，建议可以从以下几方面着手：

1. 体外细胞毒性本身的局限性

需特别指出的是：

体外细胞毒性不合格结果≠体内毒性反应≠生物相容性毒性反应

体外数据统计学意义≠毒理学意义≠生物学意义

ISO 10993-5明确指出：“任何细胞毒性反应可能都是重要的。但是，这主要预示潜在的体内毒性，仅根据细胞毒性数据不一定能确定该器械不适合给定的临床应用。”因此，如果在体外细胞毒性试验中观察到细胞毒性反应，应如何确定医疗器械的实际临床风险？例如，临床实践中，某些可溶性金属离子（如Cu、Ni等）在体外显示细胞毒性，但是在植入器械临床应用中却表现出良好的临床耐受性，在长年的临床实践中并未在人体中显示出毒性反应。再比如，在细胞毒性的标准试验中，很多检测机构都选择有注册证的乳胶手套作为细胞毒性的阳性对照，而这些阳性物质都是准允上市的产品。

这些现象一方面源于人体复杂的防御和修复机制，包括体内代谢途径的解毒作用及局部微环境的缓冲能力等；另一方面也与检测方法的高灵敏度的特点有关。人体是一个高度复杂且精密调控的有机系统，具有独特的生理耐受性和自我修复机制，再加上体外测试的高度灵敏度，促使了很多人体“无毒性”而体外细胞“中毒”的现象存在。当然，这一现象也被审评考虑在内，经验表明，面对部分细胞毒性阳性结果的器械，只要能提供证据证明产品的临床可接受性，审评也是可以接受的。

对于上述原因导致的细胞毒不合格，建议建立科学的毒理学风险评估框架：

开展化学表征（可提取物/可浸出物分析）

进行同类上市产品的比对分析

补充体内试验（如豚鼠致敏试验、家兔刺激试验、全身毒性试验）

文献数据支持（已有的临床使用史证明）

比如对于一些含有抑菌作用的避孕套，因含有对细胞的生长和繁殖不利影响的物质，导致细胞毒性不过；那么这个时候，可以通过相同上市产品的比较/体内豚鼠致敏试验/家兔阴道刺激/化学表征评价的方法来说明产品的临床可接收性。

2. 不同测试方法的适用性

FDA更推荐用MEM洗脱法进行试验，国内/欧洲更推荐用MTT定量试验。下表简单列举三种方法进行比较：

测试方法	MEM洗脱法	MTT比色法	琼脂扩散法
简介	定性 将小鼠成纤维细胞系L929暴露在受控环境中制得的器械提取物中，并在显微镜下检查细胞的整体细胞数量和活力，重点关注细胞形状和细胞质结构，根据标准给予评分	定量 一种非主观的吸光度定量测量。从活细胞产生的有色溶液中，活细胞数量的增加或整体代谢活性增加导致颜色强度的增加；将细胞活性转化为溶液的颜色深度	定性 位于细胞上层的琼脂层充当屏障，模仿表皮顶层（角质层）的功能
接受标准*	分级＞2级时被认为有细胞毒性作用（0~4）	细胞活性下降＞30%被认为有细胞毒性作用	分级＞2级时被认为有细胞毒性作用（0~4）
优点	细胞结构的可视化、细胞形态的观察和细胞内结构的观察可以提供额外的信息	标准化设备仪器，减少人为偏差，形成剂量-反应曲线； 提供定量数值与毒理学数据比较	模拟人体皮肤，适用于仅与完整皮肤接触的器械；细胞形态的可视化
缺点	由于细胞活力分析使用人工显微镜可视化，主观性强，结果的准确性具有潜在的偏差，严重依赖于评估者的经验水平	不能提供关于细胞形状、细胞内结构和其他特性的额外信息，这些信息将有助于确定试验品提取物所施加的毒性水平和类型； 对于有颜色器械浸提液，不能排除受试物颜色干扰	来自细胞形态观察者的潜在偏差；需要评估员具备一定水平的专业知识
*：参考16886/10993标准

不合适的测试方法可能会导致细胞毒性测试结果不准确；要根据不同的产品特性和不同监管的要求，选择适合自己的测试方法。如：一种带颜色的生物墨水，其细胞毒测试结果不合格，但文献资料显示该材料无细胞毒性，后来发现选用的测试方法是MTT比色法。MTT比色法是将细胞的代谢产物染成蓝色，通过溶液的颜色判断细胞的活性水平。那么，浸提液本身带颜色的医疗器械就很容易影响到测试结果，故此类器械选择MTT比色法可能不合适。类似的还有

接触镜类产品，可采用琼脂扩散法（YY/T 0719.7-2011眼科光学　接触镜护理产品　第7部分：生物学评价试验方法），

口腔类也推荐扩散法（口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法）。

这里需要额外说明，虽然琼脂扩散法允许直接测试特定器械，但一些浸出物可能无法通过琼脂层扩散或可能与琼脂发生反应，此时测试结果可能不够准确。因此，监管机构会对琼脂扩散法的测试结果较为关注，通常会要求检测机构提供证明此方法的适用性。

方法选择建议：

a) 有色浸提液的样品避免使用MTT法（如案例中的蓝黑色生物墨水）

b) 接触镜类产品优先选用琼脂扩散法

c) 需考虑监管要求差异（FDA倾向MEM浸提液法，国内/欧盟推荐MTT法）

3. 测试过程的注意事项

浸提

大部分的医疗器械样品是通过浸提的方式，将获得的样品浸提液与细胞接触从而测试器械的细胞毒性。简单讲，就是将医疗器械泡在浸提介质中，将医疗器械的毒性成分转移到浸提液中；类似于“炖鸡汤”的过程，“鸡”类比“医疗器械”，“鸡汤”类比“浸提液”。那么，如何炖出一锅“好鸡汤”？

炖鸡汤	器械浸提	标准要求
自来水？山泉水？	浸提介质种类	含血清培养基/生理盐水溶液/其他适宜的介质
整鸡？切成小块？	器械是否要切割	除非不适用性，应将材料切成小块，以使材料浸没在浸提介质中
鸡和水的比例	浸提比例	6（3）cm2：1 mL 0.2（0.1）g：1 mL
炖汤温度和时间	浸提温度	37℃,24   h / 37℃,72 h / 50℃,72 h / 70℃,24   h / 121℃,1 h
是否搅拌	动态浸提	宜在搅动或循环的条件下进行

标准的出发点倾向于确保绝对安全，但加严对于特定的器械，可能不适用。

浸提介质种类

不同浸提介质可能会影响医疗器械释放出的物质种类和数量，从而影响细胞毒性结果。

广东佛山中心血站-官亚妹探讨三种浸提介质对一次性使用血液灌流器体外细胞毒性评价的影响，发现不同浸提介质对血液灌流器细胞毒性的影响不同。其中，0.9%氯化钠浸提时的相对存活率最高，培养基次之，含血清培养基浸提时的相对存活率最低。这可能是因为用0.9%氯化钠浸提时，血液灌流器释放出的物质较少，对细胞的损伤较小；而含血清培养基浸提时，血液灌流器释放出的物质较多，对细胞的损伤较大。从而得出结论：不同浸提介质对一次性使用血液灌流器体外细胞毒性评价有显著影响，应根据实际应用场景选择合适的浸提介质进行评价，为该类医疗器械的生物相容性评价提供了参考。

广东医疗器械所也有过相关报道；一般来说，对于很多种类的医疗器械产品采用含血清的培养基进行浸提即可达到实验所需，但对于一些含有吸附作用的产品如含活性炭和树脂的血液灌流器，他们在用含血清培养基浸提时，能够吸附血清蛋白等其他一些未知的营养成分。所以对于一些有吸附作用的医疗器械产品，应该考虑在用含血清培养基作为浸提介质时，是否会因医疗器械的吸附特性导致浸提液中维持细胞生长的营养成分的不足，从而导致细胞状态不好，细胞毒性增加的假阳性结果。

另一个例子是用于冲洗手术部位的冲洗管。这些管通常由PVC制造，在用标准优先推荐的细胞毒性测试系统：含血清培养基（极性+非极性）进行浸提，可能会产生细胞毒性反应。在这种情况下，如果可以证明与设备一起使用的冲洗液只有极性，并且预计不会与患者有其他接触，则可以调整细胞毒性研究方法，仅考虑极性浸提条件，以证明临床相关条件是否对测试结果有影响。

器械是否要切割

通常，对于细胞毒性测试，需要样品切割成小块以使材料浸没在浸提介质中。但有些样品，切割可能会暴露原先没有暴露的表面（如内腔或切面），可能在测试系统中产生夸张的反应，导致细胞毒性不过。例如：弹性体、涂层材料、复合材料、多层材料等，由于完整表面与切割表面存在潜在的浸提性能差异，如能证明临床不可能接触内表面，应尽量完整地进行浸提。

灭菌方式

医疗器械常用的灭菌方式主要有环氧乙烷EO灭菌、高压蒸汽灭菌和紫外灭菌。

EO灭菌：对细胞生长产生毒性作用，需注意EO灭菌后的解析残留。

高压蒸汽灭菌：121℃，需考虑产品的耐受性。

紫外灭菌：物理灭菌方式，经济简便，光线灭菌，只适用于光能照到的表面灭菌。

安徽省食药检叶小惠探讨了不同灭菌方式对4种医疗器械或材料细胞毒性评价结果的影响，结果如图

医疗器械/灭菌方式	紫外辐照灭菌UV	高压蒸汽灭菌HT	环氧乙烷灭菌EO
一次性使用医用口罩	87%	85%	90%
手术解剖器(镊体)	87%	90%	98%
橡胶塞	85%	88%	91%
一次性使用输液器	90%	76%	67%
备注：存活率（小于70%，考虑其具有细胞毒性）

一次性使用输液器的聚氯乙烯(PVC)管路部分经UV灭菌、HT灭菌和EO灭菌后的浸提液法结果分别为1级、1级和2级，MTT法结果表明在UV灭菌和HT灭菌方式下细胞存活率均>70%，EO灭菌条件下细胞存活率<70%,具有潜在的细胞毒性作用,分析考虑可能EO灭菌方式下输液器浸提液中存在某种溶出物或其所含成分的浓度具有潜在的细胞毒性反应，而在UV灭菌和HT灭菌条件下可能破环了其成分，影响浸提液溶出物的释放，从而导致检测结果发生变化。一次性使用输液器一般适用UV灭菌和HT灭菌条件，常规选择EO灭菌方式。PVC软管在一些非无菌产品中可能也涉及,进行生物学评价时送检样品属于非无菌产品，由于细胞毒性试验要求样品属于无菌产品,企业在送检时可能会选择HT灭菌从而造成假阴性的试验结果。

4. 测试环节引入的问题

这一部分主要和检测实验室相关，细胞毒性测试毕竟是一个无菌生物试验，洁净室的等级/平板接种细胞的均匀程度/染毒量的精确度/人员熟练度/操作规范性等都会影响细胞毒性结果。因此，在进行MTT细胞毒性时可以通过空白孔的偏差/同一浓度梯度孔的偏差/50%与100%观察数据的趋势性/镜下细胞形态/MTT定量数据吻合度来判断。

5. 产品本身的原因

导管类材料

河南省医疗器械所通过对随机抽取8家生产企业的10批次涂层导尿管进行测试，发现PVC基材的涂层导管体外细胞毒性小，生物相容性高；乳胶基材的涂层导尿管，细胞毒性结果有差异。

江西省医疗器械所通过对4种导管材质[聚氯乙烯（PVC）（增塑剂DEHP）、PVC（增塑剂TOTM）、热塑性聚氨酯弹性体（TPU）、聚烯烃热塑性弹性体（TPE）]的输液器样品检测发现：一次性使用输液器细胞毒性来源为输液器导管部分；相较PVC及TPU，TPE材质导管具有相对较低的细胞毒性；且灌注法相对常规克重法更适合一次性使用输液器细胞毒性评价。

塑料中有毒物质的潜在来源：增塑剂

市场上许多医疗器械是用塑料材料制造的（例如，血袋、管套、注射器），增塑剂（例如，邻苯二甲酸盐，双酚A）被添加到塑料材料中以增加柔韧性和弹性。医疗器械行业中使用的增塑剂多为邻苯二甲酸酯，包括邻苯二甲酸双（2-乙基己基）酯（DEHP）。

DEHP及其代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）与人体内分泌紊乱有关。增塑剂不通过共价键而是更松散地嵌入塑料树脂基体中，因此，它们更容易被释放，并通过直接和/或间接方式与人体接触。常见的直接接触包括口腔和皮肤接触（例如，通过放置在口腔内或皮肤上的装置），间接接触是通过吸入或暴露于接触过含DEHP材料的液体（如血液、呼吸）。每种增塑剂从材料中迁移的速率取决于增塑剂和嵌入树脂的特性。增塑剂一旦进入体内，就会被水解成代谢物。初级代谢物因特定增塑剂而异；然而，最常见的MEHP，对苯二甲酸乙二醇酯，邻苯二甲酸乙二醇酯和邻苯二甲酸乙二醇酯，对L929小鼠细胞的细胞毒性比母体增塑剂（DEHP， DINP和DINCH）更大。当大量吸入塑化剂时，可能会产生毒性作用，影响呼吸系统、免疫系统和生殖系统等。因此，这类原材料的器械需特别注意。

脱离剂量谈毒效应，都是耍流氓

“毒性并不是有毒物质持有的属性，而是所有物质的一般属性”。“万物皆有毒，剂量决定一切”。食盐是我们日常生活中不可或缺的物质，但是随着摄入人体的食盐剂量的增加，它的“毒性”也会慢慢体现出来。器械产品也是如此；许多产品喜欢添加金属，但最终使用者接触到的金属/化合物的具体量，决定了金属/化合物在整个生物体水平上是否有毒。还应注意的是，特定的表面处理，如钝化和阳极化，可影响医疗器械中金属离子的释放，从而改变其潜在的毒理学效应。因此，对于一些潜在毒性大的原材料，可能需要对器械的表面进行保护处理，确保其无法析出或析出的量少，从而能在人体的耐受范围内。

 

三、结论

尽管常见的细胞毒性试验，如MEM洗脱试验或MTT试验，可以预估体外细胞毒性，但体外跟体内条件相差很大，体外预估结果可能高估了体内潜在的不良反应，并不总是对应于准确/有效的临床反应。在这些情况下，结合分析化学方法（如化学表征可提取/可浸出测试），科学/政府机构（如ATSDR、IRIS、ECHA）现有的系统毒性数据和已发表的同行评议的科学文章，可为评估患者的毒理学风险和临床安全性提供参考框架。另外，对最终成品医疗器械进行辅助动物试验可有助于研究体外细胞毒性阳性的临床影响，特别是不与最终用户和患者长期接触的器械。

 

四、参考文献

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2.叶小恵,张磊,章亚兵.不同灭菌方式对细胞毒性评价的研究[J].安徽预防医学杂志,2024,30(01):61-65.DOI:10.19837/j.cnki.ahyf.2024.01.014.

3.南方,杨立峰,田胜慧,等.不同浸提介质对一次性使用血液灌流器体外细胞毒性评价的影响[J].中国医疗器械信息,2020,26(05):23-24+64.DOI:10.15971/j.cnki.cmdi.2020.05.009.

4.官亚妹,邓智豪,梁惠兰,等.不同浸提介质对一次性使用血液灌流器体外细胞毒性评价的影响[J].中国医疗器械信息,2023,29(21):22-24.DOI:10.15971/j.cnki.cmdi.2023.21.011.

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6.医疗器械生物学评价　第5部分：体外细胞毒性试验[S]. 2017

7.AAMI/ISO 10993-5:2009/(R)2014. Biological evaluation of medical devices—Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Arlington, VA: Association for the Advancement of Medical Instrumentation.

 

来源：不严肃医械研究

关键词： 医疗器械 细胞毒性