抗体药物偶联物（ADC）是一类用于癌症靶向治疗的生物药物，由单克隆抗体与一种或多种生物活性载荷连接而成。迄今为止，FDA和EMA已经批准了13种不同的抗体药物偶联物用于多种肿瘤学适应症的治疗，这些ADC包括不同的连接子、细胞毒性载荷和偶联技术。本文围绕ADC类药物的放射性标记ADME相关内容展开讨论。

 

吸收、分布、代谢和排泄研究

使用放射性标记药物进行的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）和排泄（Excretion，ADME）研究在药物开发中发挥着关键作用。吸收研究可以确定新药物如何进入人体并被吸收到血液中；分布研究则考察药物如何从吸收部位转移到体内的不同组织；代谢研究确定药物代谢产物的形成、药物代谢的速度，以及形成的代谢产物是否具有潜在的活性或毒性。最后，排泄研究关注药物如何从体内被清除以及清除的速度。总体而言，这些研究为筛选药物候选物、优化给药方案以及在监管审查中解释安全性和有效性数据提供了关键信息。

对于单抗，通常不会进行放射性标记的分布、代谢和排泄研究，因为单抗被分解为天然氨基酸，这些氨基酸通常不存在安全性问题。然而，对于ADC，情况则有所不同。ADC通常通过静脉给药，吸收通常不是问题。分布方面，小分子药物与大分子（如抗体）结合后的ADC，药物的分布由抗体成分决定，抗体作为小分子的载体。当ADC与肿瘤细胞表面的靶点结合并被内吞后，细胞毒性载荷从ADC中释放出来杀死细胞。此外，ADC也可能通过内吞作用被不表达目标靶点的细胞摄取。区分ADC药物的降解和代谢有一定难度，故统称为“生物转化”。

不同的偶联技术和连接子/载荷化学性质会显著影响ADC的生物转化。一般来说，细胞毒性载荷及其生物转化产物在ADC在体内某个部位（如靶向的肿瘤或正常组织）被细胞内降解后释放到循环中。释放的载荷及其生物转化产物随后可以到达多种组织中，并进一步被代谢或被清除。如果释放的生物转化产物具有良好的细胞通透性，可以在邻近组织中发挥药理作用，称之为旁观者效应，这种效应可能是积极的或消极的，取决于邻近组织是肿瘤细胞还是正常细胞。此外，一旦产生载荷及其生物转化产物，它们将受到与传统小分子相同的药物代谢酶和转运蛋白的作用。

为了理解ADC的暴露与安全性之间的关系，必须了解完整ADC在组织中的分布、生物转化机制（不仅包括结合药物，还包括其释放的生物转化产物，如载荷），以及这些产物的最终排泄情况。由于细胞毒性载荷或其生物转化产物在组织中的积累可能会影响ADC的疗效和安全性，因此其组织滞留是放射性标记分布研究中需要重点关注的指标。此外，与所有生物治疗药物一样，ADC也可能引发抗药物免疫反应。免疫反应可能针对ADC的抗体部分、细胞毒性载荷、偶联产生的新表位，或三者的组合。这些免疫反应可能会改变ADC的分布、代谢和排泄特性。因此需要仔细进行免疫原性评估，以了解其对安全性和疗效的影响。

 

用于分布、代谢和排泄研究的技术

放射性标记是开展药物分布、代谢和排泄研究的关键技术。放射性标记可以针对ADC的抗体、载荷，或两者同时进行，通常用于评估药物偶联对抗体分布的影响，或探索细胞毒性载荷的分布情况。

传统的蛋白质标记方法通常使用γ放射性同位素125I或β、γ放射性同位素131I。使用γ放射性碘同位素需要特殊的设备和实验室设施来确保放射安全。另外需要注意的一点是，蛋白质的放射性碘化存在一个主要问题是体内脱卤作用，这种作用由脱碘酶引起，可能导致甲状腺对放射性碘的摄取增加。

89Zr是一种可用于正电子发射断层扫描（PET）研究的放射性同位素，用于在体内可视化ADC的分布。89Zr的半衰期较长，约3.27天，可以充分评估ADC在靶组织中的分布。此外，还有其他多种金属被用于抗体标记，如111In、177Lu、64Cu和225Ac。然而，使用放射性金属标记蛋白质需要使用螯合连接子，金属与连接子结合可能会改变抗体的物理化学性质，从而导致ADC的分布特性发生改变。

在动物和人体的分布、代谢和排泄研究中，β放射性同位素3H或14C通常是首选。14C通常被认为是小分子药物的首选同位素，因为它在体内因代谢而丢失的可能性较低。当然，3H的比活度比14C高得多，这对于标记像ADC这样分子量约为150 kDa的大分子具有优势。对于ADCs，通常将载荷部分用14C或3H标记，以便追踪释放的经生物转化后的生物活性物质（BPs）。

作为放射性标记的替代方法，治疗性蛋白还可以用近红外（NIR）或荧光染料进行标记。NIR标记成本较低，且不需要特殊设备或放射性安全防护。然而，抗体与染料的结合可能会改变蛋白质的物理化学性质。根据标记程度的不同，荧光团结合可能会对抗体的血浆清除和组织分布产生影响。

仅在抗体或载荷上使用一种放射性核素进行分布研究的一个缺点是，无法同时追踪抗体和载荷的分布。可以采用互补方法，如采用双重放射性标记方法（一个放射性标记在抗体上，另一个放射性标记在载荷上），以区分不同分析物的分布模式。

 

分布研究

已上市ADC产品的组织分布研究

FDA和EMA已批准了至少13种ADC上市。其中，12种ADC的蛋白部分由单抗通过连接子与细胞毒性载荷连接而成。大部分ADC（11/13），连接子可通过酶解或pH依赖性断裂。使用的细胞毒性载荷种类丰富，包括卡利奇霉素、DM1、DM4、PE38、SN38、Dxd、PBD、MMAF和MMAE。

已获批的ADC中，6款ADC（gemtuzumab ozagamizin, trastuzumab emtansine, inotuzumab ozagamicin, polatuzumab vedotin, belantabmab mafodotin, mirvetuximab soraytansine）在大鼠中进行了组织分布研究。对于trastuzumab deruxtecan，组织分布评估在食蟹猴中进行。另有3款ADC(sacituzumab govitecan, tisotumab vedotin, trastuzumab deruxtecan)，组织分布评估在荷瘤小鼠中进行，因为使用荷瘤动物有助于展示肿瘤靶向性，且肿瘤可能会影响整体组织分布。有4款ADC(brenituxmab vedotin, moxetumomab pasudotox, enfortubmab vedotin, loncastuximab tesirine)，未进行组织分布研究。此外，有6款ADC组织分布采用了标记细胞毒性载荷的方式完成。需要注意的是，大鼠或小鼠的组织分布结果应谨慎解读，因为啮齿动物可能并非ADC的药理学相关动物种属，可能无法评估靶点介导的组织分布。

为了进行ADC的组织分布分析，ADC的单克隆抗体部分通常用125I、3H、14C、111In或89Zr标记，而细胞毒性载荷通常用3H或14C标记。将放射性标记连接到抗体上可以追踪ADC中的单抗成分在体内的分布，而标记到载荷上则可以追踪ADC的生物活性部分。

可以采用不同的方法评估放射性标记ADC或标记载荷的组织分布，例如通过组织解剖后进行燃烧和液体闪烁计数（LSC），或通过定量全身放射自显影（QWBA）进行组织分布分析。血液和组织评估通常在单次静脉给药后持续长达14天。

未对ADC进行组织分布研究的可能原因之一是，单剂量PK研究中的表观分布容积（Vss）表明，完整ADC的组织分布有限。一般来说，ADC组织与血浆的AUC比值小于1，与ADC的较小Vss一致，表明ADC主要分布在血浆中。在给药后数小时内，通常在高血流灌注的组织中检测到放射性，随后随着时间推移逐渐减少，在组织中未观察到明显的持续存在。从已有数据看，ADC通常无明显的器官蓄积。相比之下，放射性标记的游离细胞毒性载荷的组织分布快速且广泛，Vss较高，组织与血浆的AUC比值大于1，表明游离载荷的组织分布广泛。

 

QWBA用于ADC分布研究的考虑

QWBA是一种广泛应用于放射性标记化合物及其代谢物组织分布研究的成像技术。在动物分布研究中，QWBA数据通常用于估算人体ADME研究中放射性吸收剂量，从而评估放射性剂量的安全性。

尽管QWBA技术应用广泛，但也存在一些局限性。首先，其分辨率限制了在啮齿类动物等临床前种属中的组织分布分析，仅能到达组织/器官水平，无法进行细胞水平的评估，因此无法完成原位受体结合的评估。其次，在放射性标记的ADC的组织分布分析中，无法区分完整ADC、游离载荷或生物活性部分，因此估算的组织PK参数可能反映的是多种放射性标记成分的混合分布。此外，如前文所言，ADC抗体部分通常不与啮齿动物靶点结合，可能导致分布特征的变化。此外，由于担心灌注会影响实际组织分布，通常不在分析前对动物进行灌注以去除血液残留，因此无法完全排除组织中血液污染的可能性。

尽管存在这些局限性，QWBA数据仍为非靶点介导的器官和组织暴露提供了良好的评估基础，有助于了解放射性标记ADC及标记生物活性部分在器官和组织中的滞留情况。尽管根据ICH S9指南，对于抗肿瘤药物，如果啮齿动物与人体的分布存在差异，则不需要进行ADC的组织分布研究，但QWBA分布数据仍可能为潜在的毒理学和药理学作用位点提供线索。此外，使用荷瘤动物进行组织分布分析可以帮助更好地理解特定ADC的肿瘤靶向特性及其在肿瘤组织中的选择性蓄积能力。

 

其它成像技术

除了经典的通过QWBA或LSC这些传统组织分布分析方法外，还可以利用单光子发射计算机断层扫描（SPECT）/CT进行分子成像，以非侵入性方式实时获取放射性标记ADC在体内的组织分布定量图像。可以实现多次对同一动物进行成像，追踪标记有γ射线放射性同位素（如125I）的抗体的组织分布，从而减少实验动物的使用数量。然而，仅追踪抗体作为递送载体无法确定细胞毒性载荷在体内是否保留或丢失，也无法确定递送载体在所用生物系统中是否保持完整。因此，对载荷和抗体进行双重放射性标记可能有助于评估ADC在体内的稳定性。需要注意的是，与QWBA全身分布分析相比，SPECT/CT的空间分辨率有限。

此外，如前文所述，QWBA仅显示总放射性标记成分的分布，无法确定组织中观察到的放射性是否来自完整ADC、释放的载荷或BPs。为了确定肿瘤组织中的主要BP成分，可以应用液体萃取表面分析微液相色谱-串联质谱（LE SA-μLCLC-MS/MS）技术，鉴定具体结构。

除了先进技术，为了区分ADC和游离载荷分布的不同，双重放射性标记也是一种选择。比如抗体部分标记3H，载荷部分标记14C。或者载荷部分标记131I，抗体部分标记89Zr。比如Cohen等人使用一种双重放射性标记的ADC，载荷部分标记131I，抗体部分标记89Zr，用于研究赖氨酸连接的tubolysine抗体的分布。这种同位素组合可以使两种同位素的分布曲线在没有干扰的情况下进行检测。结果显示，在结肠和回肠内容物中131I水平高于89Zr，很可能是由于游离载荷的存在。此外，在肿瘤组织中89Zr的摄取高于131I，这可能是因为131I在ADC内化后从肿瘤中释放，而89Zr残留在细胞内。

 

代谢和排泄研究

小分子化合物通常会开展代谢研究，生物药则往往不需要。ADC本质上是由小分子连接到单抗上构成的，因此代谢研究主要集中在识别从抗体上释放的小分子生物转化产物，开展类似小分子的 ADME 研究，这些研究是针对释放的有效载荷进行的，例如体外跨种属代谢物识别、血浆蛋白结合和血液分布，以及用于支持 DDI 评估的体外研究。当然，很多试验并未使用放射性标记技术开展，不在本文讨论之列。

 

已上市ADC开展的代谢和排泄研究

在13种获批的ADC中，有9种进行了放射性标记的生物转化研究。未进行放射性标记生物转化研究的4种ADC分别是moxetumomab pasudotox、sacituzumab govitecan、loncastuximab tesirine和tisotumab vedotin。

对于loncastuximab tesirine，其使用的载荷是SN38，这是一种由1996年获批的前药伊立替康产生的小分子化合物，当时曾进行过放射性标记的ADME研究。对于tisotumab vedotin，申请人引用了含相同载荷（MMAE）的其他ADC brentuximab vedotin的既往注册信息。换句话说，这俩ADC用的不是新载荷，已有过充分的研究。

在进行放射性标记生物转化研究的9种ADC中，有6种既进行了放射性标记ADC的研究，也进行了放射性标记载荷的研究。Mirvetuximab soravtansine仅进行了用氚标记的ADC的体内大鼠研究，未进行放射性标记载荷的研究。可能是因为ADC上的放射性标记位于载荷上，从而能够追踪和识别释放的生物转化产物。Mnfortumab vedotin和belantamab mafodotin这两款ADC仅进行了放射性标记载荷的生物转化研究，而未对ADC本身进行放射性标记。对于enfortumab vedotin，与之前讨论的tisotumab vedotin类似，其MMAE载荷通过缬氨酸-瓜氨酸可切割连接子与抗体相连，而这种连接子也曾用于其他两种获批的ADC（polatuzumab vedotin和brentuximab vedotin），且在这两种ADC的生物转化研究中，对ADC进行了放射性标记。故enfortumab vedotin仅开展了放射性标记载荷的研究。

在9种报告了放射性标记生物转化研究的ADC中，有6种同时开展了放射性标记的体内和体外研究。3种ADC（polatuzumab vedotin、trastuzumab deruxtecan和mirvetuximab soravtansine）仅开展了放射性标记体内研究。当然，这并不意味着没有使用非放射性标记的ADC或载荷进行体外研究。实际上，很可能进行了这类研究，因为许多这类研究并不需要使用放射性标记。同样，在体内研究中，也并非所有的生物转化研究都需要使用放射性标记。例如，brentuximab vedotin和inotuzumab ozogamicin的人体研究中，就对非放射性标记的生物转化产物进行了定量和/或鉴定。

 

开展ADC人体放射性标记研究的挑战

尽管FDA最近发布了关于在人体中进行放射性标记物质平衡研究的草案指南，但该指南仅适用于新的化学实体（NCE），而不适用于需要提交生物制品许可申请（BLA）的ADC。有趣的是，该指南提到，对于单克隆抗体、内源性物质及其类似物（例如肽、激素、寡核苷酸治疗药物）等已知代谢和排泄途径的药物，基于基础药理学和非临床ADME信息，不推荐进行人体物质平衡研究。因此，该指南部分内容可能也适用于ADC的抗体部分，但不适用于连接子-载荷部分。

总体而言，专门针对ADC开发的监管指南较少。然而，FDA最近发布了一份关于ADC临床药理学考虑的指南，其中建议对ADC及其释放的载荷进行ADME评估，以评估是否需要在特殊人群中进行临床药理学研究，但并未推荐进行动物或人体的放射性标记物质平衡研究。

中国CDE发布了《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》。该指南建议，当ADC释放的小分子生物转化产物（BPs）是新分子（即之前未在人类中进行临床试验）且ADC靶向非典型器官（如大脑，即非肿瘤学适应症）时，应进行放射性标记的ADME研究。此外，如果BPs是新的载荷，建议根据ICH M3或ICH S9指南进行非临床研究，以确定这些BPs是否在人体中过度形成。

据查，目前获批的ADC基本没有在人体中开展放射性标记物质平衡研究的先例。在所有获批的ADC中，仅brentuximab vedotin进行了一项排泄研究，在癌症患者中对原型药在血浆和排泄物中的含量进行了定量分析。在为期一周的收集期间，仅回收了23.5%的母体化合物。

在之前的一份白皮书中，不推荐在人体中进行物质平衡研究，至少对于晚期癌症患者是这样的。由于ADC在肿瘤学中通常使用的细胞毒性药物作为载荷，因此在健康志愿者中给予这类产品并不合适，此类评估必须在癌症患者中进行。ADC的半衰期可能在几天到几周之间，这使得设计一项能够收集足够排泄物的研究非常具有挑战性，并且在肿瘤患者中进行此类研究可能并不符合伦理。而较短时间的ADME研究可能导致获取的物料平衡数据不完整。此外，由于这些生物转化产物的浓度通常非常低，识别含有载荷的外周生物转化产物可能具有挑战性。

根据ICH S9，对于包括ADC在内的肿瘤产品，通常不需要对人体代谢物及其在毒性测试种属中的覆盖情况进行调查。然而，对于那些用于非肿瘤学领域的慢性非致命疾病的ADC（不受ICH S9指南的覆盖），可能需要对人体和动物血浆中的ADC及其生物转化产物进行准确定量。

药物的ADME研究通常在人体中使用14C放射性标记药物进行，放射性剂量高达约100 μCi。一般通过标准放射性检测技术（如液体闪烁计数法）来确定物质平衡以及血浆和排泄物中的放射性情况。对于在组织和血浆中半衰期较长且剂量较低的药物，标准的人体ADME研究设计并不适用，因为为了确定血浆和组织的半衰期以及血浆和排泄物中的代谢物谱，人体需要暴露于较高剂量的放射性。

为了解决这一问题，开发了所谓的微量示踪剂方法，将低至0.1-1μCi的放射性剂量给予健康志愿者或患者。在这种低剂量下，放射性体内负荷极低，因此无需进行上述用于支持剂量设计的临床前QWBA研究。为了满足此类微量示踪研究中对14C放射性检测灵敏度增加的需求，加速器质谱（AMS）技术就派上了用场。AMS技术过去主要用于具有长药代动力学消除半衰期或高黑色素和组织结合的小分子，或者在放射性安全方面因14C放射性暴露而存在问题的药物。然而，AMS技术也已应用于生物制品。

首次将AMS应用于生物制品的药物研究是用于评估14C标记重组蛋白在大鼠中的药代动力学。此外，一个行业小组进行了一项比较生物分析研究，使用三种分析平台（AMS、LC-MS/MS和LSC）评估豚鼠中三种治疗蛋白的胚胎暴露。LSC和LC-MS/MS均未能提供胎盘转移的可报告结果，而AMS能够以fg/mL的灵敏度，仅使用10 μL样本，提供豚鼠中PEG-Adnectin和PETET-dAb的转移比结果，低至0.2%。

荷兰应用科学研究组织（TNO）的一个小组在2015年首次证明，通过在少量健康受试者中使用微剂量，可以成功获得人体中新型生物制品的药代动力学数据。在仅进行有限的临床前测试后，进行了一项首次人体0期/1期试验，以评估重组人胎盘碱性磷酸酶（hRESCAP）的安全性和药代动力学。药代动力学分析显示，从微剂量（53 μg14C -hRESCAP）到治疗剂量（5.3 mg14C -hRESCAP），该蛋白在健康志愿者中的暴露量呈线性关系。然而，对于蛋白质（包括ADC）的分布、代谢和排泄研究而言，人类微剂量研究并非最佳方法。微剂量下的靶点介导药物处置可能会影响ADC的清除率和暴露量，从而导致与较高治疗剂量不同的药代动力学。

AMS技术的发展使得实验室规模更小、更紧凑的仪器得以实现，并通过气态CO₂自动进样。尽管AMS已证明其独特性能，并减少了空间需求以便在常规实验室中使用，但其安装和维护仍然并非易事。原则上，基于激光光谱学的光学检测方法可以以更简单、更经济的配置实现与AMS竞争的结果。该领域的最新应用是腔环衰荡光谱（CRDS）。CRDS已用于分析14C标记的metelimumab在大鼠中的情况，并获得了与AMS相似的检测限。

AMS和CRDS似乎都是测量临床研究中14C微量的有前景的技术。值得强调的是，这些放射性检测技术的进步可能有助于检测循环中ADC的代谢产物。目前，ADC及其BPs的结构鉴定主要通过高分辨率质谱完成，但由于它们在循环中的浓度通常较低，成为一个挑战。然而，下一代质谱仪器不断改进的检测限以及上述额外技术可能有助于在未来填补这一空白。

最后，附上已获批ADC产品开展的非临床分布、代谢和排泄研究汇总表。

来源：药理毒理开发曾子像

关键词： 基于放射性标记的ADC药物ADME研究