在RP-HPLC分析中，当待分析物分子富含O、S、N等配位原子时，可能诱发“络合效应”，导致目标色谱峰保留漂移或/和峰型异常（如分裂、拖尾）。本文结合笔者日常工作中遇到的实际案例、药典及文献报道，探讨该现象产生的原因及解决策略。所述为个人经验，如有疏漏，敬请同行指正。

 

2-吡啶甲酸衍生物络合案例

 

某品种中2-吡啶甲酸衍生物残留量检测时发现目标色谱峰裂分，且拖尾严重（如图1所示），与历史尖锐对称现象不符。具体色谱条件为：色谱柱为封端C18（4.6*250mm，5μm）；流动相为0.04mol/L磷酸氢二钾溶液（用磷酸调节pH至6.0±0.2）-甲醇（80:20）；流速为每分钟1.0ml；柱温为30°C；检测波长为264nm；进样量10μl；溶剂为流动相。

 

图1：2-吡啶甲酸衍生物检测异常图谱

 

通过实验，排除了色谱柱原因（如筛板堵塞导致溶质绕流、色谱柱污染或柱效降低）、pH不适（pH未偏离待分析化合物pKa 1.5个单位）、残存硅醇基次级作用导致峰型异常的可能。

 

考虑到2-吡啶甲酸衍生物中含吡啶氮和羧基氧，存在与金属离子发生络合配位的风险，可能造成2-吡啶甲酸衍生物峰型的畸变。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 是极强的金属螯合剂，能与Fe³⁺，Cu²⁺，Al³⁺ 等金属离子竞争络合，当流动相中添加该物质后，能否改善峰型?将流动相更换为0.04mol/L磷酸二氢钾与0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（用磷酸调节pH为pH6.0 ±0.2）-甲醇（75:25），其他色谱条件不变，结果显示裂分现象消失，峰型对称（如图2所示）。由此可以推断造成峰型裂分拖尾的根本原因为“络合效应”。

 

图2：在原有流动相中添加5mM乙二胺四乙酸二钠后2-吡啶甲酸图谱

 

为避免重新验证及方法变更，如何保证现行方法能够继续适用于日常检测放行？通过减少色谱体系中的金属离子浸出或/和通过掩蔽色谱体系中的金属离子可能得以实现。

 

将色谱柱前后的不锈钢管线更换为同内径同长度的Peek管（拟减少色谱体系中的金属离子浸出），随后采用10mM乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na) –甲醇（75:25）为冲洗剂，以1.0ml/min流速冲洗色谱系统3h（掩蔽色谱体系中的金属离子），然后用现行操作规程中规定的流动相平衡色谱体系40min后，重复进样考察加标供试品中2-吡啶甲酸衍生物的峰型，结果表明目标物在26h内峰型正常，满足现行标准，但拖尾因子呈增大趋势，28h后峰型呈现裂分趋势（如图3所示）。

图3：2-吡啶甲酸衍生物0h（上，峰型正常）及28h（下，呈现裂分趋势）图谱

 

羟基吡啶酮并吡嗪衍生物络合案例

 

实验室在进行羟基吡啶酮并吡嗪衍生物有关物质分析方法开发时，采用30mM高氯酸钠水溶液（每1000ml含高氯酸0.5ml）作为A相，乙腈作为B相，线性梯度洗脱，主物质拖尾严重。将流动相A更换为30mM高氯酸钠与0.5mM乙二胺四醋酸二钠水溶液（每1000ml含高氯酸0.5ml）后，峰型显著改善（如图4所示）。

图4：羟基吡啶酮并吡嗪衍生物峰型

 

某喹诺酮类原料药络合案例

 

某喹诺酮类原料药采用相应的盐酸盐形式对照品进行清洁取样方法开发时发现聚四氟乙烯板材淋洗液主峰峰形正常，而铝合金淋洗液主峰申舌甚至有裂分趋势。选择该喹诺酮类原料药相应的游离碱形式对照品进行清洁取样方法开发，聚四氟乙烯板及铝合金板材主峰峰型均恢复正常（如图5所示）。当在流动相中添加0.5mM乙二胺四醋酸二钠后，继续进样考察盐酸盐形式对照品对应的淋洗液，峰型亦恢复正常。结合文献[1, 2]可大致推断出该喹诺酮类原料药铝合金淋洗液主峰异常的原因（如图6所示）。

图5：某喹诺酮类原料药不同形式对照品淋洗液主峰峰型

图6：某喹诺酮类原料药铝合金淋洗液主峰异常的原因推测

 

药典专论络合案例

 

通过检索中国药典专论，总结出会与金属或金属离子发生络合的品种如下表所示。

 

“络合”结构汇总

 

当待分析物分子富含O、S、N等配位原子时，有可能诱发“络合”效应，如四环素类药物，其与金属离子可能发生络合的位点较多，如O10-O11、O11-O12、O12-O1、O1-N酰胺、O3-O酰胺、O3-N4以及O12a-N4[3]。如喹诺酮类药物，其与金属离子可能发生络合的位点一般为O3-O4[1, 2]。

 

对于“络合”导致的峰型异常应对策略

 

上述案例均表明EDTA具备极强的金属络合作用，在进样前用其冲洗色谱系统及色谱柱，可以在一定时间内保证金属/金属离子无法进一步与目标物络合，但随着不含EDTA流动相的持续冲洗，EDTA屏蔽效应会持续减弱直至消失（以2-吡啶甲酸衍生物为例，阐明内在逻辑，详见图7）。一劳永逸的做法是直接在流动相中添加强金属络合剂如EDTA。

 

 

图7：2-吡啶甲酸衍生物色谱峰裂分/拖尾原因（络合）及添加EDTA后峰型改善的作用机理示意图

 

参考文献

[1] Perez Guaita, D., Sayen, S., Boudesocque, S., et al., 2011. Copper(II) influence on flumequine retention in soils: macroscopic and molecular investigations. J Colloid Interface Sci 357, 453-459.

[2] TUREL I. The interactions of metal ions with quinolone antibacterial agents [J]. Coordination Chemistry Reviews, 2002, 223(1/2): 27-46.

[3] De Almeida W B, Dos Santos H F, Zerner M C. A theoretical study of the interaction of anhydrotetracycline with Al (III) [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1998, 87(9): 1101-1108.

 

来源：药事纵横

关键词： RP-HPLC 络合效应