本指导原则为药品生产企业加强制药用水全过程的微生物控制提供指导。

 

制药用水的质量和应用范围应满足制药用水（通则0261）的要求。药品生产企业应选择符合现行法规标准且质量稳定的原水，制药用水系统的设计、运行、消毒、监测和维护应能够防止微生物污染和繁殖，保证所使用的制药用水符合预期用途要求。

 

本指导原则的内容包括制药用水中微生物的特点、微生物监测及微生物控制与风险提示。

 

1制药用水中微生物的特点

 

1.1微生物的来源

 

制药用水中微生物的来源包括外源性污染和内源性污染。外源性污染主要来自原水、设备、介质（填料、药剂）、维护和取样过程等，例如系统故障或防护缺失、消毒措施不当、活性炭、离子交换树脂的原始生物负载较高、取样和使用等操作技术不规范等。外源性污染可能不是常见的水系统微生物，而是土壤、空气甚至是人员来源的微生物。检出此类微生物更可能表明取样、检测过程存在污染或系统组件故障，应根据需要进行评估或调查，并依据评估或调查结果采取相应的措施。

 

内源性污染主要来自制备系统和分配系统本身。不恰当的设计和维护可能导致存在于原水中的微生物吸附在活性炭床、离子交换树脂、滤膜和其他制备单元表面并形成生物被膜，也可能吸附在悬浮颗粒上，例如活性炭床细颗粒或破裂的树脂颗粒。当生物被膜脱落或微生物呈浮游状态时，可能污染下游制备单元及分配系统。分配系统中的管道表面生成的红锈、粗糙的焊缝、排列不齐的法兰、阀门和管道死角处均可能发生微生物附着、繁殖并形成生物被膜，从而成为微生物污染的持续来源。

 

1.2微生物的类群

 

药品中主要的污染微生物为细菌、霉菌和酵母菌。革兰阳性菌、霉菌和酵母菌通常不适合在水系统中生存和定殖，如果存在于原水中，可能影响制药用水制备系统的早期阶段。制药用水中检测到革兰阳性菌、霉菌或酵母菌，通常与取样或检测过程等外源性污染有关。

 

革兰阴性菌是水系统中存在的主要微生物，因其能够产生内毒素且可在水系统中繁殖，需要重点关注和控制。常见的革兰阴性菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、莫拉菌属（Moraxella）和许多其他类似假单胞菌的微生物[假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的成员]。这些细菌可在水制备系统和分配系统的表面定殖，如不加以控制，可能会影响制备单元的功能并扩散到下游，在分配系统表面（例如储罐、管道、阀门、软管和其他表面）形成生物被膜，或进入工艺用水和配制用水中。部分能够形成生物被膜的革兰阴性菌属于条件致病菌，可在寡营养的条件下生存和繁殖，且可能对药品生产中常用的防腐剂和消毒剂具有抗性。这些革兰阴性菌可能在某些药品或原辅料、中间产品中繁殖，增加产品质量风险，威胁患者健康。

 

埃希菌属（Escherichia）、沙门菌属（Salmonella）、志贺菌属（Shigella）、沙雷菌属（Serratia）、变形杆菌属（Proteus）、肠杆菌属（Enterobacter）和克雷伯菌属（Klebsiella）等肠道致病菌，可能会污染饮用水源。若当地的污水和水源控制不到位，必要时需对此类细菌进行控制，以使原水的质量符合要求。

 

人类致病病毒（例如粪便来源病毒）可能存在于水源中，一般可被一些特定的净化单元去除，如反渗透（RO）、一定强度的紫外灯等，且由于没有宿主细胞，通常人类致病病毒不太可能在制药用水系统中生存或定殖。

 

1.3生物被膜

 

生物被膜是细菌分泌胞外聚合物（EPS）基质附着于物体表面而形成的一种由细菌群体组成的三维结构化群落。生物被膜形成和传播途径通常为黏附、表面聚集、增长、释放。在水系统中，生物被膜形成的场所包括各种接触水或潮湿的表面，常见于原水系统、热交换器、RO膜、离子交换树脂、流速慢或内壁粗糙的管道、O形圈、垫圈等。

 

定殖在水系统的生物被膜为群体内微生物获得营养物质提供了条件，也增强了微生物对外界不良因素的抵抗能力。生物被膜的检测和去除十分困难。生物被膜可通过结晶紫染色法、ATP荧光检测法、电子扫描显微镜或激光共聚焦显微镜等进行检测。对于生物被膜应进行有效的预防控制，结合生产过程进行风险评估并制定可行的控制方案。一旦发现生物被膜，除了对生物被膜中的微生物进行杀灭外，还应考虑有效去除生物被膜的碎片，因为这些脱落的碎片会导致水系统中细菌内毒素水平升高，并且成为水系统中微生物的营养来源。可选择适当的清洁剂（例如含氢氧化钠或氢氧化钾的复合配方清洁剂）进行管道清洁，增加水流速度，并配合适当的消毒剂去除生物被膜。必要时可考虑更换管道等部件。应基于安全和毒性数据来制定清洁剂和消毒剂的残留可接受标准，并考虑对应的残留检测方法和方法学验证。

 

1.4细菌内毒素

 

细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的组分之一，其主要化学成分是脂多糖（LPS），在细菌死亡后自溶或裂解时释放。因内毒素是热原，某些特定用途的制药用水需严格控制内毒素含量。内毒素可能由原水引入，也可能由在水系统中的细菌释放，形成生物被膜的革兰阴性菌是制药用水中细菌内毒素的重要来源。由于细菌内毒素会在细菌死亡后释放，消毒后可能会出现内毒素的激增。

 

控制潜在革兰阴性菌污染以及水中的游离内毒素对于制药用水的内毒素控制至关重要。控制措施包括使用上游净化单元来降低进水的生物负载、工艺控制（例如，设备设计、热消毒、紫外线消毒、过滤器、材料表面粗糙度和流速）等，以尽量减少系统内表面生物被膜的形成和水系统中浮游微生物的产生。去除内毒素的方法主要包括活性炭、超滤、反渗透、离子交换、蒸馏等工艺。

 

2微生物监测

 

现有的检测方法主要针对水系统中的浮游微生物，以浮游微生物的数量来反映水系统中微生物控制是否处于稳定和良好的状态。检测结果仅代表取样时水系统中浮游微生物的数量，并不能完全反映水系统中微生物的污染程度。因此，需要基于风险制定微生物监测方案，对水系统中的微生物数量和类群进行持续监测，根据趋势变化情况评估水系统的运行状态。

 

2.1取样

 

建立适当的取样方案对于制药用水的质量控制十分关键。取样方案应经过验证。取样点应具有足够代表性，能够覆盖关键的控制点、所有的使用点以及潜在的最差情况。不同取样点的取样频率应基于风险评估和验证数据设定。一般来说，取样方案应覆盖所有分配系统的循环管路，关注循环管路中的代表点和风险点，如送水点和回水点。典型的取样方案是对各个水点进行轮流取样，尽可能达到时间和空间的平均分配。

 

制药用水的微生物监测可分为过程控制（process control）和质量控制（quality control）两种目的。过程控制监测的目的是确认制药用水的制备、分配系统运行是否稳定且处于受控状态，质量控制监测的目的是确认所使用的制药用水质量是否符合要求。过程控制监测取样时，取样点设置应尽可能覆盖整个系统，以反映系统的运行状态，并在出现问题时确定具体位置。过程控制监测取样可使用专用取样接口、取样前冲洗，避免操作、取样口引入的污染，尽可能反映管道内制药用水中浮游微生物的污染水平。质量控制监测取样则应尽量在使用点进行，取样过程尽可能与实际用水时保持一致，以获得实际用水时的真实微生物污染水平。

 

取样应有详细的操作规范，取样人员应经过培训和考核。取样应使用无菌容器，并注意取样后转运和保存过程中容器的密封性。如使用外接管取样，应在取样后立即拆除。取样时应记录取样人、取样时间、取样点、取样量等信息。取样量应能够满足检验需求。取样后应尽快进行检验（一般在2小时内），若不能立即检验，则应置于2～8℃保存，保存时间一般在12小时内，最多不超过24小时。不能满足上述条件时需要进行风险评估。

 

2.2检测方法

 

水系统中能够存活的微生物主要以能够形成生物被膜的革兰阴性菌为主，这类细菌对碳源利用广泛，对营养要求低，因此一般更适合在寡营养的培养基（例如R2A琼脂培养基）中生长，最适生长温度一般不超过35℃，部分微生物生长缓慢。因此，制药用水（通则0261）中推荐的微生物检测方法为经薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30～35℃培养不少于5天。由于不同制药用水系统中的微生物类群存在差异，使用不同的计数方法、培养基、培养温度和培养时间可能会影响检出微生物数量和种类。例如，慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）使用薄膜过滤法检测时，菌落较小不易观察，需培养7天或更长时间，如水系统中存在该菌，使用平皿法更有助于观察计数。因此，药品生产企业可根据自身水系统中微生物类群的特点在制药用水（通则0261）推荐检测方法的基础上进行适当调整。一般情况下，选择在较短时间内可检出较多微生物数量和种类的检测方法，并需要对所使用的方法进行验证，以证明所选用的方法优于或等同于药典推荐方法。

 

若日常监测结果均为小于1cfu或计数水平较低，可考虑增加检验量，以获取更多水系统中的微生物数量和种类信息，反映水系统中的微生物水平和变化趋势。

 

为更快速地获得检测结果，及时发现和处理不良趋势，药品生产企业可选择快速微生物检测方法进行制药用水的微生物监测，包括在线的微生物检测方法。

 

2.3监测标准

 

药品生产企业应在满足制药用水（通则0261）中微生物限度标准的基础上，根据制备和分配系统特点、取样环节、水的预期用途及历史数据等设定合理的日常微生物监测标准，包括警戒限度和纠偏限度。

 

警戒限度是指微生物监测结果超出正常范围，但未达到纠偏限度，需要引起警觉，可能需要采取纠正措施的限度标准。纠偏限度是指微生物监测结果超出可接受标准，需要进行调查并采取纠正措施的限度标准。警戒限度、纠偏限度一般基于过去的趋势分析数据并经过合理的风险评估后选择适宜的方法（例如正态分布法、百分位数法、非参数公差限值法等）建立。不同方法计算得到的警戒限度、纠偏限度不同，可根据实际情况选择合适方法，并定期动态调整。除微生物数量超过设定好的纠偏限度外，以下情况也应引起关注并按需采取纠正措施：同一取样点连续多次超过警戒限度；不同取样点同时超过警戒限度；检出对工艺或产品具有潜在危害的微生物；历史数据均为零，但连续出现非零结果等。除采取必要的纠正措施和预防措施外，还需调查事件原因，并评估事件的影响，采取必要的补救措施。

 

一般来说，注射用水中应没有微生物存活，但考虑到取样过程中可能引入的微生物污染，制药用水（通则0261）中注射用水微生物限度标准为不大于10cfu/100ml。因此，注射用水系统中一旦检出微生物，即使没有超出警戒限度或纠偏限度，也应予以关注并进行评估或调查。

 

2.4微生物鉴定

 

制药用水微生物监测除进行微生物计数外，还应关注某些可能对产品或生产工艺具有潜在危害的微生物。可定期对制药用水中分离微生物进行适当水平的鉴定，有助于掌握菌群结构和开展微生物污染溯源分析，评估水系统来源的微生物污染风险。注射用水检出微生物一般应进行鉴定。当制药用水微生物监测结果异常或出现新的菌落形态、其他微生物污染偏差有可能关联制药用水时，也建议对微生物展开鉴定。鉴定分离得到的微生物可用于培养基促生长能力试验及微生物方法适用性试验等。微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则（指导原则9204）进行。

 

2.5数据分析与偏差处理

 

应定期对制药用水微生物监测数据进行回顾和分析，通过对收集的数据开展趋势分析，总结和评估制药用水系统运行状态，有助于发现系统性问题。定期的趋势分析可用于制定合理的警戒限度、纠偏限度和监测方案，当出现异常趋势时能尽早采取纠正措施和预防措施。日常微生物监测数据、异常监测结果以及实验室发生的偏差等均应进行趋势分析，趋势分析不局限于微生物监测结果的数据分析，还需要正确评估微生物污染风险，包括微生物污染数量、种类和特定微生物污染检出的频率，并结合实际情况，进行系统综合性评估，如系统确认和验证状态、预防性维护和相关变更等。

 

当微生物监测结果超出纠偏限度或出现异常情况时，应按照偏差管理程序文件在规定时间内进行记录、报告、调查、处理及采取纠正措施和预防措施，并对相关措施的有效性进行评估。

 

2.6快速微生物检测方法

 

制药用水在药品生产过程中广泛使用，在制备系统、储罐及分配系统中以动态循环流动的形式存在。制药用水的微生物过程控制监测更适合使用快速微生物检测方法（RMM），尤其是在线、近在线的方法，从而更快速、更准确地监测水系统的运行状态，在出现异常情况时及时采取措施。

 

常见的制药用水快速微生物检测方法包括：ATP生物发光法、激光诱导荧光法、微菌落荧光染色法、固相细胞计数法、流式细胞分析方法、核酸扩增法等。企业可结合自身制药用水系统特点（微生物数量、类群等）及实际需求，选择适合的快速微生物检测方法。可参考药品微生物检验替代方法验证指导原则（指导原则9201），按照药品生产过程的质量控制要求对所使用的方法进行开发和验证。验证时可选取制药用水系统常见的生长缓慢微生物（如慢生根瘤菌）作为试验菌株，重点关注方法的灵敏度、水系统菌株的适用性及与传统方法的相关性。鼓励增加使用快速微生物检测方法与传统方法并行，在积累一定数据并经验证和风险评估后逐渐替代传统方法。许多快速微生物检测方法，尤其是实时或近实时的检测方法，所产生的信号单位不同于传统方法的菌落形成单位（cfu）。例如对微生物细胞进行直接检测的方法产生的信号是细胞数量，结果可能高于传统方法所产生的cfu结果。因此，当应用快速微生物检测方法时，其结果与传统方法相比某些参数如准确度等可能存在差异，但二者应有明确的相关性，关注对微生物监测数据的趋势分析，确保快速微生物检测方法对微生物污染风险的监测效果优于或等同于传统方法。

 

3微生物控制与风险提示

 

制药用水的微生物控制应符合现行版《药品生产质量管理规范》及相关指南的要求，在制药用水系统的全生命周期予以考虑，并基于风险建立微生物污染控制策略，包括原水控制、系统设计、系统确认、系统持续监控和维护、其他微生物控制措施及风险提示等，并根据监测数据及运行情况，持续改进控制策略。

 

3.1原水控制

 

用于制备制药用水的原水质量至关重要。原水的污染微生物有可能进入后续制备的制药用水中，因此，应根据制备工艺、预期用途制定合理的可接受标准（例如微生物指标、细菌内毒素等），对原水进行适当的检验以确认符合相应标准。根据原水的质量控制水平可采取一定的处理和控制措施，例如消毒、过滤、调整运行参数等，从而保证后续制药用水的质量符合要求。同时，应关注环境、季节和供应变化引起的原水质量变化。

 

3.2系统设计

 

水系统的设计，应考虑生产所需水的质量要求、用水量、原水的供应和质量情况、预处理及纯化工艺、清洁、消毒或灭菌方式、取样点的设计以及能耗和厂房条件等。根据水的预期用途，选择适宜的工艺流程（包括预处理工艺和进一步的纯化工艺）。根据预估的用水量，选择合适的预处理和纯化设备、管道和储罐尺寸，保证一定的循环和置换次数。应考虑清洁、消毒或灭菌方式及其控制微生物的有效性，系统材料对清洁、消毒或灭菌方式的耐受性及消毒剂残留的去除。对取样点进行适当的设计，以避免污染和方便操作。某些预处理单元（如多介质过滤器、保安过滤器、活性炭过滤器、软化器、陶瓷过滤器等）和分配系统管道可能发生微生物富集和增殖。应采取适当的化学或热消毒措施，并定期更换滤材。

 

3.3系统确认

 

制药用水系统应进行确认以保证制备系统所生产、分配系统所供应的水的质量符合预期用途的要求。在水系统确认初期，应尽可能增加微生物监测的取样点和取样频次，随着系统稳定和数据积累，根据运行和使用情况逐步减少取样点和取样频次，形成日常运行时的取样方案。水系统确认还应包括微生物检测方法的研究，包括培养基、培养温度和时间、接种方式的选择等。应对系统确认期间检出的微生物进行适当的鉴定，建立水系统微生物分布数据库，便于后期的异常情况调查。起草和制定清洁、消毒和维护程序，并进行验证。

 

3.4系统持续监控和维护

 

经验证的制药用水系统应通过持续的监测、控制和维护保证水质稳定。随着系统验证完成以及系统的逐渐稳定，根据制水工艺、监控数据和运行状况，确定微生物取样方案、检测方法、微生物指标的警戒限度和纠偏限度、清洁消毒和维护程序等。在后续的运行和预防性维护过程中定期进行风险评估并采取改进措施。持续对运行过程进行监控，对监测数据定期进行回顾和分析，根据历史数据调整警戒限度和纠偏限度。按照程序采取控制微生物和防止微生物生长繁殖的措施，例如温度控制（高温或低温）、清洁、消毒或灭菌、定期更换滤材、正反冲洗及再生等。对于异常结果（超趋势、超纠偏限度或发现新的微生物种属及对工艺或产品具有潜在危害的微生物等），应进行评估、调查和根本原因分析，根据需要采取纠正措施和预防措施。制定系统回顾的周期。回顾系统运行以来的微生物监测方案的合理性（取样点的选择、取样频次的确定、取样方式的防污染措施等），微生物数量和种类变化情况，警戒限度和纠偏限度制定的合理性，异常结果的调查情况，清洁、消毒或灭菌程序的有效性，系统维护的执行情况，纠正措施和预防措施的有效性等。

 

3.5其他微生物控制措施及风险提示

 

制药用水系统的设计、运行和维护的微生物控制措施还包括：保证管道内壁、连接处光滑，材质防腐蚀；与外界连通的阀门等处注意防污染设计；避免存在死角；预处理单元定期采用反冲、化学或热消毒、再生、更换滤材等；保证原水质量；保证一定的水流量，防止水流停滞；控制系统内温度；适当位置安装紫外灯消毒；定期进行热消毒或灭菌；进行适当的化学清洁和消毒；定期检查，维护，更换O形圈、垫圈等零部件等。

 

制药用水的微生物监测具有一定局限性。药品生产企业应对制药用水系统中存在的微生物类群特点、检测方法进行充分的研究和验证，同时考虑制药用水的类别、预期用途与可接受标准，基于风险确定微生物监测方案，配合合理的微生物污染控制措施，保证制备系统所生产、分配系统所供应的水的质量稳定且符合要求。另外，寡养型微生物一旦进入无菌产品，在无菌检查的培养体系中可能无法检出，存在漏检的可能，因此，无菌产品生产用水应关注这类微生物的监测和控制。

 

《中国药典》2025版-9209 制药用水微生物监测和控制指导原则

 

来源：Internet

关键词： 制药用水 微生物控制