摘 要： 建立了一种超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱快速筛查和测定化妆品中盐霉素的方法。样品以饱和氯化钠分散后，经乙腈超声提取，离心，取上清液过滤，采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相等度洗脱。在正离子（ESI+）模式下，采用Full MS/dd-MS2模式采集盐霉素的质谱信息，构建盐霉素筛查数据库进行快速筛查，以外标法进行定量。结果表明，盐霉素的质量浓度在1.0～100.0 μg/L范围内与色谱峰面积的线性关系良好，线性相关系数均大于0.999。在不同基质中的检出限为0.13～0.29 μg/kg，定量限为0.43～0.98 μg/kg。在高、中、低3个加标水平下，平均回收率为87.3%～106.3%，测定结果的相对标准偏差不大于8.8%（n=6）。该方法可用于化妆品中盐霉素的快速筛查和测定。

 

关键词： 超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱法； 盐霉素； 化妆品； 快速筛查

 

随着社会经济的不断发展和人们消费水平的日益提高，我国已成为化妆品第一大消费国，化妆品安全问题也日益成为消费者的关注焦点[1]。目前，《化妆品安全技术规范》（2015年版）中收录的非法添加药物成分多为激素、抗生素、抗组胺类等临床用药，暂未有化妆品中非法添加兽用药物的报道。盐霉素作为聚醚类抗生素的一种，是上世纪70年代发展起来的一种具有离子载体性质的兽用抗生素，目前多用于畜禽饲养行业中的促生长剂和广谱抗球虫药[2]，未有针对化妆品中非法添加盐霉素的相关检测方法。盐霉素具有较强的细胞毒性，过量使用该化合物易导致在体内残留，严重危害人体健康[3‒5]，因此研究盐霉素在化妆品中残留量的检测方法，对保障化妆品产品质量安全具有极其重要的意义。

 

目前，盐霉素的检测方法主要有免疫学法[6]、微生物法[7]、高效液相色谱法[8]、高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法[9‒10]等。近年来，高效液相色谱法-串联质谱法因其高灵敏度和高选择性，已成为化妆品中非法添加药物成分的含量分析最常用的方法[11]，但三重四极杆质谱法在缺少标准品的情况下难以做到化合物的快速筛查。随着科技的不断进步，高分辨质谱因其具有更高的质量准确度和超高的分辨率，可在无标准品情况下，无需优化目标物子离子和相关参数，可以直接对比母离子和碎片离子精确质荷比，从而实现化合物的快速定性确证，目前已被广泛应用于化妆品中非法添加物定向和不定向筛查[12‒13]。

 

笔者采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱联用技术，建立化妆品中盐霉素的快速筛查和测定方法。该方法样品处理便捷、测定结果准确、分析时间短，且利用其超高分辨率和准确质量数特性，可同时完成化妆品中盐霉素的定性筛查和定量测定的过程，为监管部门对化妆品中非法添加的分析检测提供了可靠的技术支持。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Thermo Fisher Vanquish型，美国赛默飞世尔科技公司。

四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪:Q Exactive Focus型，美国赛默飞世尔科技公司。

电子分析天平：XS205DU型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多科技（中国）有限公司。

超声波清洗器：KQ-250E型，昆山市超声仪器有限公司。

离心机：Multifuge X1R型，美国赛默飞世尔科技公司。

乙腈、甲醇、甲酸铵：均为色谱纯，德国默克股份联合公司。

甲酸：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

盐霉素标准品：纯度（质量分数）为98%，上海安谱璀世标准技术服务有限公司。

化妆品样品：包含液态水基类、膏霜类、乳类、蜡基类等常见类别，分别购自商场、批发市场、网店等场所。

实验用水：纯净水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 质谱仪

离子化模式：ESI+；离子源加热温度：350 ℃；金属传输毛细管温度：320 ℃；辅助气：氮气，流量为3.0 L/min；鞘气：氮气，流量为0.6 L/min；喷雾电压：4.20 kV；采集模式：一级全扫描/数据依赖二级质谱扫描（Full MS/dd-MS2）；Full MS分辨率：70 000；扫描范围：100～1 000；dd-MS2分辨率：17 500；归一化碰撞能量：15，35，50 eV。

1.2.2 色谱仪

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；等度洗脱：15% B；流量：0.3 mL/min；进样体积：3 μL；柱温：40 ℃。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

称取化妆品样品0.2 g（精确至0.001 g），置于15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠水溶液，涡旋混匀后，加入8 mL乙腈（蜡基类样品先加入1 mL四氢呋喃），涡旋30 s，使样品分散，超声提取20 min，摇匀，以8 000 r/min离心10 min，吸取上清液于10 mL容量瓶中，乙腈定容至标线，混匀，上清液经0.22 μm有机相滤膜过滤，作为样品溶液。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取盐霉素标准物质适量，精密称定，用乙腈配制成质量浓度10 μg/mL的标准使用溶液。精密量取10 μg/mL标准使用溶液适量，用流动相配制成盐霉素质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列标准工作溶液。

称取适量份数的空白基质样品，按1.3.1方法处理，滤液为空白基质提取液。精密量取10 μg/mL标准使用溶液适量，用空白基质提取液配制成质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的基质匹配系列标准工作溶液。1.3.3 质谱数据库的建立取质量浓度为50 μg/L的盐霉素标准溶液，按照1.2仪器工作条件进行测定，获得盐霉素的保留时间、母离子精确质量数和碎片离子精确质量数等数据，采用mz Vault软件建立二级碎片离子质谱库，并将分子式、CAS号等信息添加至谱库中，将化合物的数据信息导入Tracefinder 软件中，构建化妆品中盐霉素的高分辨筛查数据库。盐霉素的质谱参数见表1。

表1   盐霉素的UPLC-Orbitrap-HRMS质谱分析参数

Tab. 1   Analytical parameters of Salinomycin by UPLC-Orbitrap-HRMS

 

1.3.4 化合物筛查和定量检测

取0.2 g化妆品样品，按照1.3.2方法处理后，续滤液按1.3.4方法采集质谱信息，将已采样品与数据库进行比对，当化合物的一级和二级信息均与谱库中化合物匹配时，则可以确证为阳性，确证的目标物采用母离子进行外标法定量。

 

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件优化

盐霉素分子中含有多个环状醚键，在甲醇、乙腈中有较好的溶解性。分别考察了以甲醇、乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、甲醇-乙腈（体积比为1∶1）、乙腈-水溶液（体积比为80∶20）为提取溶剂时膏霜乳类化妆品中空白加标样品中盐霉素的回收率，结果如图1所示。从图1可以看出，乙腈、甲醇、甲醇-乙腈、80%乙腈作为提取溶剂时回收率均可达到90%以上，但均存在不同程度的乳化现象。饱和氯化钠盐析由于其能有效抑制化妆品中乳化层的形成，可加速提取溶液的分层，有利于目标物的提取，在化妆品前处理中得到了广泛应用。进一步比较乙腈-饱和氯化钠溶液、甲醇-饱和氯化钠溶液、甲醇-乙腈-饱和氯化钠溶液3种提取溶剂系统对膏霜乳类化妆品的提取效果如图1所示，从图1中可以看出，乙腈-饱和氯化钠溶液提取效果最好，且乳化现象更弱，与甲醇相比，乙腈提取的脂溶性杂质更少，因此选定乙腈-饱和氯化钠溶液作为提取溶剂。

图1   不同提取溶剂对膏霜乳类样品中盐霉素的提取效率

Fig. 1   Exatraction efficiencies of salinomycin in creams and milk samples using different solvents

1—甲醇；2—乙腈； 3—甲醇-乙腈； 4—80%乙腈溶液；5—乙腈（含0.1%甲酸）；6—乙腈-饱和氯化钠溶液；7—甲醇-饱和氯化钠溶液；8—甲醇-乙腈-饱和氯化钠溶液；

2.2 流动相的选择

考察了水-乙腈、0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液-乙腈、0.01 mol/L乙酸铵水溶液-乙腈、0.01 mol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.01 mol/L乙酸铵水溶液-甲醇等流动相体系下盐霉素的出峰情况及峰形。结果发现，同等条件下，0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相体系时，盐霉素峰形和质谱响应均较好，且与提取溶剂保持一致的条件下，可减少溶剂效应的发生，干扰更小的同时测定结果更准确。

此外，为考察等度洗脱时流动相中不同乙腈比例对测定结果的影响，以质量浓度为50 μg/L的盐霉素标准溶液为研究对象，观察当乙腈比例分别设置为15%、20%、25%、35%时盐霉素的出峰情况。结果表明，当乙腈比例为15%时，盐霉素出峰时间最早且响应值高达6.35×107，而随着流动相中乙腈比例的增加，盐霉素质谱响应均存在不同程度的下降，且出峰时间大幅度延长，不符合化妆品中盐霉素快速筛查测定的需求。综合考虑，流动相体系选择0.1%（体积比）甲酸水溶液-乙腈，等度洗脱，乙腈比例为15%。

2.3 方法耐用性考察

为考察方法的耐用性，分别考察了盐霉素在Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国沃特世公司)、Agilent Eclipse Plus C18柱[100 mm×2.1 mm，3.5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司]、Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm，美国赛默飞世尔科技公司）、Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司) 4种色谱柱上的分离效果。结果发现，盐霉素在4款色谱柱中均能正常出峰，且峰形和响应均较好，表明该方法耐用性好，适用于实验室日常分析需求。

2.4 质谱条件的选择

采用100 μg/L盐霉素标准溶液注入电喷雾离子源中，考察正、负模式下盐霉素响应值，发现盐霉素仅在正离子模式下有响应。正离子模式下，盐霉素可形成[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+离子，其中以[M+Na]+（m/z 773.481 03）离子峰度最高，因此以[M+Na]+（m/z 773.481 03）作为母离子。在碰撞能量为15，30，50 eV时，二级质谱主要碎片离子分别有m/z 431.236 94、m/z 265.143 44、m/z 531.325 76。盐霉素分子离子提取色谱图如图2所示。

图2   盐霉素的提取离子色谱图

Fig. 2   Extracted ion chromatograms of the salinomycin

2.5 基质效应的考察

化妆品基质复杂，样品中基质成分可能导致目标离子的信号增强或抑制[14‒15]而影响分析结果的准确性，因此需对分析方法的基质效应进行考察。采用溶剂和膏霜类、乳类、蜡基类、液态水基类空白基质提取液分别配制溶剂系列标准工作溶液和基质系列标准工作溶液，基质效应（EM）采用计算公式EM=[基质匹配标准溶液曲线斜率/溶剂标准曲线斜率- 1]×100%进行评价，结果绝对值越大表示基质效应越强。当|EM|≥50%时，为强基质效应；当|EM|≤20%时，为弱基质效应，当20%＜|EM|＜50%时，为中等基质效应。结果表明，4种基质的基质效应结果分别为-20.07%、-18.95%、4.06%、-2.26%，均为弱基质和中等基质效应。为尽可能降低方法定量结果误差，仍采用基质匹配标准曲线计算样品中盐霉素的含量。

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围、检出限和定量限

按照1.3.2方法配制基质匹配系列标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进样测定。以盐霉素的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，得到标准工作曲线及相关系数。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）分别计算方法检出限和定量限。盐霉素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。由表2可知，盐霉素的质量浓度在1.0~100.0 μg/L范围内与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.999。不同基质下的检出限为0.13～0.29 μg/kg，定量限为0.43～0.98 μg/kg，表明该方法灵敏度较高，满足定量分析的要求。

表2   盐霉素的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 2   Linear regression equation, correlation coefficients,LODs and LOQs of salinomycin

 

2.6.2 精密度和样品加标回收试验

移取适量膏霜类、乳类、蜡基类、液态水基类空白基质样品，分别加入一定体积的10 μg/mL的标准使用溶液，按照1.3.1方法进行处理，制备成高、中、低不同浓度水平的加标溶液，在1.2仪器工作条件下进行6次平行测定，试验结果见表3。由表3可知，4种不同基质下，盐霉素的平均回收率为87.3%～106.3%，6次测定结果的相对标准偏差为0.5%～8.8%，表明该方法具有较高的准确度和良好的精密度，满足分析要求。

表3   样品加标回收试验结果（n=6）

Tab. 3   Results of spiked recycling test(n=6)

 

3 结论

基于UPLC-Orbitrap-HRMS建立了化妆品中非法添加兽用药物-盐霉素的筛查及测定方法，并分别对色谱条件、质谱条件和样品预处理方法等进行了优化。

与已有研究相比，该方法基于高分辨质谱的精准相对分子质量和多级碎片信息建立了盐霉素的质谱数据库，可实现化妆品中盐霉素的快速筛查，同时，利用盐霉素母离子的精确质量数直接定量，无需逐个优化子离子及相关参数，可大幅降低检测时间，且轨道阱质谱的超高分辨率可很好地避免基质干扰而产生的假阳性现象，大大提高了样品测定结果的准确性。

综上所述，该方法简单高效、准确度高、灵敏度好，可实现化妆品中盐霉素的快速定性确证及定量分析，为化妆品中风险物质的监测提供了有效的技术支撑。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱法 化妆品 盐霉素