保证药品安全、有效、质量可控是药物研发和评价应遵循的基础原则。对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制药品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试，来全面考察药品质量。一般地，每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证。

 

方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。

 

方法学验证的内容-检出限和定量限

 

检测限和定量限是分析方法的重要属性，在中国药典2020年版分析方法验证指导原则中规定这2项是重要的验证指标，定量分析需考虑定量限；限度分析需测定检测限，且在该版本指导原则中删除了校正因子以及其中定量限的规定。

 

根据ICH Q2 以及各国药典方法学验证内容一般需要评价的典型验证项目有: 专属性、准确度、精密度( 重复性和中间精密度) 、检测限、定量限、线性、范围和耐用性等。根据分析方法的类型不同，需要验证的项目不同，见表1。

 

 

定义

 

 

检测限（Limit of Detection，LOD）：系指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。因此需要注意的是在检出限附近不能进行准确的定量，且报告未检出时应附上方法的检测限。

 

检测限的测定是通过对一系列已知浓度被测物的试样进行分析，并以能准确、可靠检测被测物的最小量或最低浓度来建立。

 

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指试样中被测物能被定量测定的最低量。其测定结果应具有一定的准确度和精密度。

 

定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。

 

另外需要注意的是：

 

•定量限/检测限有些地方会翻译为Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，这个根据各个公司自己规定执行即可。

 

检测限和定量限的测量方法

 

 

指导原则中规定了三种方法测定检测限和定量限：

 

（1）直观法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检出（或定量测定）的最低浓度或量。

 

对于目测法而言，需要提供逐级稀释的图谱，并说明稀释过程。如下图采用采用初始浓度0.4ng/ml逐级稀释，最后目测观察0.10ng/ml的浓度相当于检测限浓度。

 

（2）信噪比法：用于能显示基线噪声的分析方法，即将已知低浓度试样检出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检出（或定量）的被测物质最低浓度或量。一般以信噪比3:1或2:1时（或10:1）相应浓度或注入仪器的量确定检测限（或定量限）。

 

（3）基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法。按照LOD=3.3δ/S或LOQ=10δ/S公式计算，式中LOD为检测限，LOQ为定量限，δ为响应值的偏差，S为标准曲线的斜率。其中δ可以通过以下方法获得：①测定空白值的标准偏差；②采用标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差来代替。

 

方法学验证中，应在申报资料中说明是采用上述何种方法来测定检测限或定量限的。

 

检测限和定量限的常见问题

 

检测限和定量限常采用信噪比法测定。该计算方法下的检测限与定量限是通过对照品逐级稀释的方法获得的，没有考虑任何样品制备步骤的影响，因此其值往往比分析方法本身的实际检测限与定量限低，而且每台仪器也不一样，因此信噪比法是用来考察仪器本身性能的，与方法本身的检测限或定量限还是不一样的。信噪比法受到的影响因素比较多，例如所用色谱柱的柱效、检测器的氘灯寿命等。例如，下图中峰形尖锐的信噪比高，s/n=11，此时检测限和定量限都较低。

 

尽管信噪比法有诸多问题，但目前仍是方法学验证中最常用的计算方法。从目前国内提交的申报资料来看，检测限和定量限评价一般采用信噪比的方法来确定，存在问题较小，有时，为了保证方法的灵敏度，有时可采用灵敏度较好的PDA/DAD检测器进行检测限和定量限的考察。

 

通常检测限应低于限度的1/30，定量限应低于限度的1/10，如果达不到这一要求，可适当放宽，只要规定定量限应比ICH规定的杂质的报告限低即可（例如50%报告限）。

 

由于灵敏度受仪器、色谱柱、试剂、泵系统、检测器等的影响很大，因此为了保证方法的检测能力，有些药物的质量标准中规定了灵敏度溶液的信噪比作为系统适用性要求来考察整个色谱系统的灵敏度，相信这种方法以后会应用越来越多。

 

在指导原则中还有一句话很重要：“上述方法获得的检测限和定量限数据须用含量相近的样品进行验证，应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果，包括准确度和精密度验证数据。”

 

如何进行检测限和定量限的验证呢？常见的做法是采用杂质加标的方法进行验证，例如在供试品溶液中加入相当于检测限或定量限浓度的杂质，考察加入后的色谱图中信噪比是否符合要求。定量限的精密度验证目前基本都做到了，常采用配制6份定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%的方法进行评价。有时也进行定量限浓度的准确度验证，可接受限度可参考上述准确度项下的规定，有时也可以适当放宽。

 

对于滴定方法而言，不必验证方法的检测限和定量限，而应更重视方法的准确性、精密度和专属性。

 

参考文献

 

[1] 中国药典2020年版通则9101分析方法验证指导原则（第二次征求意见稿）

 

[2]梅希，2020版药典9101<分析方法验证指导原则>要点浅析：药事纵横

 

[23]李飞1，李云2：对药物研发中分析方法验证的几点考虑，中国新药杂志 2021.05

 

来源：Internet

关键词： 药物分析方法学 检出限 定量限