问：我新建了一种液相分离方法，但该方法似乎对 pH 值的变化非常敏感。这是一个简单的反相色谱方法，我没有使用任何的离子对试剂。我发现保留时间每天都有很大的变化，我可以确认 pH 值确实存在微小变化。问题出在哪里？

答：从您对问题的描述来看，您所处理的是：pKa 值接近流动相 pH 值的离子型化合物。因此，您需要处理两种保留时间明显不同的化合物。例如，这可能是质子化和非质子化形式的酸。带电形式化合物的保留因子要比不带电形式的要小得多。两者之间的平衡取决于 pH 值。流动相 pH 值的微小变化会改变化合物两种形式的比例，从而影响保留时间。

因此，有必要严格控制 pH 值。由于您已经做了一些实验，您可能已经获得了足够的信息来定量了解保留时间与 pH 值的关系。如果还没有，可以做一些对照实验来获得这方面的知识。此外，您还可以查看该方法的历史记录。这些信息应该是在方法稳健性测试过程中产生的。一旦有了依赖性，您就需要决定您可以接受的保留时间波动范围。然后计算 pH 值调整的精度。即使在困难的情况下，±0.02 pH 单位的精度也应该足够了。

 

问：很难精确调节 pH 值。如果只加一点点酸，pH 值就会发生很大变化。

答：不幸的是，这表明您使用的不是缓冲液。缓冲液的定义是：它可以缓冲少量酸或碱的 pH 值，也就是说，加入酸或碱后，pH 值的变化应该很小。这种维持 pH 值的能力称为缓冲能力。它取决于缓冲液的浓度和缓冲离子的 pKa。在缓冲离子的 pKa 值时，缓冲能力最大。表 1 给出了 HPLC 中常用的一些缓冲液的 pKa。请注意，它们是在水中测量的，没有添加有机溶剂。加入有机溶剂后，pKa 值会发生变化。但一般来说，包括您的分析物在内的所有化合物的 pKa 都会发生相同的偏移。

对于 HPLC 中常用的缓冲液浓度，缓冲液的 pH 值应保持在缓冲离子 pKa 值附近 ±1.5 个 pH 单位的范围内。对于 5 mM（毫摩尔）以下的极稀释缓冲液，您可能需要将范围进一步缩小到 pKa 附近的 ±1 个 pH 单位。

如表 1 所示，磷酸的 pKa 值约为 2 和 7。其中 4.5 处于中间位置，磷酸在此 pH 值下没有任何缓冲能力。要缓冲 4.5 的 pH 值，您需要使用不同的缓冲剂，例如乙酸。

同样，pH 值为 7 的乙酸铵溶液也不是缓冲液，而是盐溶液。乙酸铵“缓冲剂”的使用已变得很流行，因为乙酸铵易挥发，可与质谱检测器一起使用。但在 pH 值为 7 时，乙酸铵并不是缓冲剂，除非出于其他原因需要使用盐，否则流动相中最好不要使用乙酸铵。

表 1.常用缓冲液的 pKa 值（25°C 时）

缓冲液	pKa
乙酸	4.75
氨水	9.24
硼酸 一级电离	9.24
硼酸 二级电离	12.74
硼酸 三级电离	13.80
柠檬酸 一级电离	3.13
柠檬酸 二级电离	4.76
柠檬酸 三级电离	6.40
2-吗啉乙磺酸（MES）	6.15
草酸 一级电离	1.27
草酸 二级电离	4.27
磷酸 一级电离	2.15
磷酸 二级电离	7.20
磷酸 三级电离	12.38
三氯乙酸	0.52
三乙醇胺	7.76
三乙胺	10.72
三氟乙酸	0.50
三羟甲基氨基甲烷 (Tris)	8.08

 

问：如何改进方法？

答：如果使用的缓冲液 pH 值不合适，只需从表 1中选择更合适的缓冲液即可。通常情况下，更换缓冲液不会影响分离效果，否则您可能需要进行额外的调整。

有时，由于检测器的限制，无法更换缓冲液。我们已经提到过质谱仪需要使用挥发性缓冲液。基于羧酸的缓冲液不太适合低紫外检测，因为本底吸收较高，会导致噪音过大。如果找不到与检测兼容的缓冲液，那就麻烦了。您要么可以接受现有的保留变异性，要么就应该在所使用缓冲液的 pKa 值或接近 pKa 值的条件下重新制定方法。这显然会大幅改变色谱图，您需要从头开始重新优化方法。这可能不是一个好消息，但从长远来看，您会得到更好的结果。

我通常建议在方法开发过程中首先选择缓冲液，从而确定一般的 pH 值范围，然后利用溶剂选择性对分离进行微调。这种方法开发策略既快速又高效。它还能避免在缓冲液 pH 值方面出现错误。在下一次方法开发中，您不妨考虑一下这种方法。

来源：Internet

关键词： 液相方法开发