嘉峪检测网 2024-08-02 08:18
导读：建立高效液相色谱波长切换法同时测定复方愈创木酚磺酸钾口服溶液中苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯6种防腐剂含量。
摘 要： 建立高效液相色谱波长切换法同时测定复方愈创木酚磺酸钾口服溶液中苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯6种防腐剂含量。采用Waters XSelect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，甲醇作为流动相A，0.1%乙酸铵溶液（用乙酸调节pH值至4.5）作为流动相B，梯度洗脱，流量为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长分别为226、256 nm，进样体积为10 μL。6种防腐剂在质量浓度0.2～28.6 μg/mL内与色谱峰面积呈良好线性关系，相关系数均为0.999 9，精密度试验测试结果的相对标准偏差为0.1%～0.6%，样品加标平均回收率为98.8%～102.2%。该方法操作简单，专属性强，准确度高，重复性好，可用于复方愈创木酚磺酸钾口服溶液的防腐剂检测，为生产企业的处方、生产工艺和质量标准的把控提供参考作用。
关键词： 复方愈创木酚磺酸钾口服溶液； 防腐剂； 波长切换； 高效液相色谱
复方愈创木酚磺酸钾口服溶液是以盐酸异丙嗪、愈创木酚磺酸钾、氯化铵等多种组分作为原料配制而成的复方感冒药，临床上用于感冒及过敏性支气管炎引起的咳嗽、多痰。盐酸异丙嗪为抗组胺药，能对抗过敏反应所致的毛细血管扩张，降低毛细血管通透性，有轻度的支气管平滑肌解痉作用，亦有明显的中枢安定作用及一定的镇咳作用；愈创木酚磺酸钾是强力祛痰剂，使呼吸道腺体分泌增加，痰液被稀释，易于咳出。氯化铵为盐类祛痰药，能反射性地增加呼吸道黏膜腺体的分泌，从而使痰易于咳出，有利于粘痰的清除。
多剂量口服液体制剂由于多次开启使用，容易被微生物污染，易引起质量的变化，往往需要加入适量的防腐剂来抑制微生物滋生[1]。苯甲酸、山梨酸及羟苯酯类均具有抑制微生物的繁殖作用，是口服溶液中常用的防腐剂[2‒3]。但是防腐剂如果摄入过量会对人体产生一定的毒副作用，对人体的健康产生危害[4‒5]。目前很多药品标准中均未设置防腐剂含量测定的方法，导致药物的监管存在一定的难度。
目前防腐剂的测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法[6‒9]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[10‒11]、毛细管电泳(CE)法[12‒13]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[14‒15]。GC-MS、LC-MS/MS使用成本高，且样品处理相对复杂，对于企业来说普及性不高；CE方法样品进样量有限，且分离重现性易受电渗的影响。笔者采用HPLC波长切换法，对于测定不同种类的防腐剂来说灵敏度高，响应好，采用梯度洗脱能更好的分离6种防腐剂。在厂家提供的处方中发现，不少厂家都添加了苯甲酸或苯甲酸钠、羟苯乙酯作为防腐剂，为了考察其添加的量是否在规定的范围之内，笔者根据6种防腐剂的特征，建立了HPLC波长切换法测定复方愈创木酚磺酸钾口服溶液中6种防腐剂的含量，为该口服溶液防腐剂的控制、筛查提供参考依据。
1、 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
电子分析天平：XD205DU型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。
高效液相色谱仪：Agilent 1260型，配DAD检测器、ChemStation工作站，美国安捷伦科技有限公司。
超纯水仪：Milli-Q3800型，美国密里博公司。
苯甲酸对照品、山梨酸对照品、羟苯甲酯对照品、羟苯乙酯对照品、羟苯丙酯对照品、羟苯丁酯对照品：质量分数分别为99.9%、99.6%、99.9%、99.9%、99.6%、99.8%，中国食品药品检定研究院。
复方愈创木酚磺酸钾口服溶液样品：共99个批次，来自全国14个生产企业。
甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。
乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 色谱条件
色谱柱：Waters XSelect HSS T3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国沃特世科技有限公司)；柱温：26 ℃，进样量：10 μL；检测波长：226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯)；流动相：以甲醇作为流动相A，以0.1%乙酸铵溶液(用乙酸调节pH值至4.5)作为流动相B，流量为1.0 mL/min；梯度洗脱，洗脱程序详见表1。
表1 梯度洗脱程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.3 溶液配制
混合对照品储备液：分别精密称取苯甲酸11.44 mg、山梨酸10.84 mg、羟苯甲酯10.77 mg、羟苯乙酯10.72 mg、羟苯丙酯10.73 mg、羟苯丁酯10.81 mg，置于同一20 mL容量瓶中，加入20%（体积分数，下同）乙腈水溶液使溶解并稀释至标线，每种防腐剂的质量浓度约为500 μg/mL。
混合对照品溶液：精密量取混合对照品储备液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液稀释至标线。
系列混合标准工作溶液：精密吸取混合对照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液稀释至标线，摇匀，然后精密量取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置于不同10 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容置标线，配制成系列混合标准工作溶液。
样品溶液：取复方愈创木酚磺酸钾口服溶液样品0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液定容至标线。
阴性空白溶液：按处方比例制备不含苯甲酸、山梨酸及羟苯酯类的空白辅料，按处方配比精密取样，置于100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容至标线，作为阴性空白储备溶液；精密量取1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容至标线。
1.4 实验方法
取混合对照品溶液、系列混合标准工作溶液、样品溶液、阴性空白溶液及20%乙腈水溶液，按照1.2色谱条件进行试验分析，记录色谱图及色谱峰面积，按外标法计算6种防腐剂的含量。
2、 结果与讨论
2.1 流动相组成的考察
考察流动相为甲醇-水和乙腈-水组成时测定结果的差异发现，用甲醇作为有机相时各色谱峰的峰型比较好。再考察流动相为甲醇-水和甲醇-0.1%乙酸铵溶液组成时测定结果的差异发现，在水中加入0.1%乙酸铵有助于分离度的提高，同时拖尾因子减小，更有利于测定。羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯在流动相为甲醇-0.1%乙酸铵溶液(体积比为55∶45)时出峰时间很慢，需要增加甲醇的比例才能洗脱出来，因此选择了梯度洗脱的模式。考察0.1%乙酸铵溶液不同pH值(3.0、3.5、4.0、5.0)对测定的影响，结果显示甲醇-0.1%乙酸铵溶液(乙酸调pH值为4.5)为流动相时，峰型好且出峰时间适宜，分离度较好，理论塔板数高。
2.2 检测波长的选择
分别提取苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的DAD扫描图，结果发现苯甲酸最大吸收为226 nm，羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯最大吸收为256 nm。安捷伦1260液相色谱仪可以选择多个通道同时测定，也可选择在某个时间段进行波长切换测定，因此苯甲酸出峰后直接切换成256 nm，从而能够满足6个防腐剂都在最大吸收波长处测定，以便结果的分析。
2.3 专属性考察
取1.3项下的混合对照品溶液、加标样品溶液、阴性空白溶液，在1.2色谱条件下分别进样测定，记录色谱图见图1。混合对照品溶液中6种防腐剂的分离度均大于5.0，样品溶液中各色谱峰的分离度均大于2.0，阴性空白溶液不干扰测定。
图1 HPLC典型色谱图
Fig. 1 Typical chromatogram of HPLC
1—苯甲酸； ；2—山梨酸； 3—羟苯甲酯；4—羟苯乙酯； 5—羟苯丙酯； 6—羟苯丁酯
2.4 线性关系
取系列混合标准工作溶液，按1.2色谱条件进样，测定各色谱峰面积。分别以防腐剂峰面积y为纵坐标，对照品质量浓度x (μg/mL)为横坐标，绘制标准工作曲线，计算线性回归方程。将进样得到的信噪比，折算当信噪比S/N=3时的质量浓度确定为检出限，结果见表2。
表2 六种防腐剂的线性关系
Tab. 2 Linear relationship of six preservatives
2.5 稳定性试验
取混合对照品溶液，于室温放置，分别于第0、1、2、4、8、16、24 h时进样测定，测定各防腐剂的色谱峰面积，按外标法计算所测得的苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的含量及相对标准偏差(RSD)，见表3。表3结果表明，样品溶液在24 h内稳定。
表3 稳定性试验结果
Tab. 3 Result of stability test
2.6 精密度试验
精密量取阴性空白溶液0.2 mL，加入混合对照品储备液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容至标线，平行配制6份，按1.2色谱条件进样，记录峰面积，结果见表4。由表4可见，苯甲酸、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯，羟苯丙酯，羟苯丁酯的RSD为0.1%～0.6%，表明该方法精密度良好。
表4 方法精密度试验结果
Tab. 4 Method precision test results
2.7 样品加标回收试验
用混合对照品储备液作为加标回收标液，精密量取加标回收标液0.8、1.0、1.2 mL，每个浓度水平取3份，共9份，分别加入阴性空白溶液0.2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入20%乙腈水溶液，定容至标线。按1.2色谱条件测定各防腐剂的色谱峰面积，并计算回收率，结果见表5。各防腐剂的平均回收率为98.8%～102.2%，表明样品加标回收率良好。
表5 样品加标回收试验结果
Tab. 5 Sample recovery test results
3、 结论
用Waters XSelect HSS T3柱，以甲醇作为流动相A，0.1%乙酸铵溶液(用乙酸调节pH值至4.5)作为流动相B，流量为1.0 mL/min；进行梯度洗脱，检测波长为226 nm (苯甲酸)和256 nm (山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和羟苯丁酯)，经方法学验证，用该方法同时测定6种防腐剂，操作简单，分离度好，灵敏度高，为复方愈创木酚磺酸钾口服溶液防腐剂的控制、筛查提供参考依据，进一步加强药品监管，提高药品质量，从而保证药品的抑菌效力。
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