摘 要： 建立高效液相色谱-串联四极杆质谱（HPLC-MS/MS）法定量分析人参组培不定根中11种皂苷成分。样品经粉碎研磨，以70%甲醇水溶液为溶剂进行超声提取，离心过滤后测定。采用C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），用水和乙腈进行梯度洗脱，流量为0.3 mL/min，柱温为35 ℃。质谱采用电喷雾电离源，负离子扫描，多反应监测模式进行检测。11种皂苷的质量浓度在0.1～10 μg/mL（Rb1为0.2～10 μg/mL）范围内和响应强度线性相关，相关系数均大于0.995，各皂苷的定量限为0.001～0.010 g/kg，加标回收率为90.43%～97.82%，相对标准偏差为1.93%～6.33%（n=6）。该方法操作简单，分析时间短，灵敏度高，准确可靠，适用于人参组培不定根中多种皂苷类成分的同时测定。

关键词： 高效液相色谱-串联四极杆质谱法； 人参组培不定根； 皂苷

 

药用植物人参为五加科人参属植物[1]，现代研究认为，人参的主要药理活性物质为人参皂苷，它们不仅可以调节血压、保护神经系统、增强免疫系统等，还表现出抗肿瘤、抗衰老及抗氧化等多种活性[2‒5]。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，栽培技术复杂，生产受到很大限制。人参组培不定根是利用植物细胞的全能性，由人参外植体在培养基中诱导出愈伤组织，经过增殖、定向诱导等步骤形成的不定根[6‒7]。它既可实现人参种苗的快速繁殖，又可快速获取人参的次生代谢产物，给药用人参资源可持续利用带来广阔的前景，因此，对人参不定根开展皂苷活性成分的检测是利用组织培养技术研究人参药材生产栽培、开发利用的基础和前提。

在以往的研究中，往往通过测定皂苷类成分的总量来评估人参组培不定根的品质，缺少对各个皂苷单体的含量测定。人参皂苷种类繁多，目前已发现单体皂苷超过60种，主要包括原人参二醇型、原人参三醇型和齐墩果酸型等[8]。在现行《中华人民共和国药典》(2020版)中，对人参皂苷Rb1、Re和Rg1三种主要成分制定了限量指标[9]，但还是缺少其他皂苷指标的检测，因而无法完全实现人参及其培养体药材的质量控制和品质评价等需求。高效液相色谱法(HPLC)已被广泛用于人参皂苷的含量测定研究[10‒12]，高效液相色谱与高分辨质谱的结合(如HPLC-Q/TOFMS、HPLC-Q/OrbitrapMS)已越来越多地应用于人参皂苷的定性研究和结构鉴定[13‒15]。然而，人参皂苷显示出低波长紫外吸收特征，导致使用HPLC进行检测时基线噪声增加和灵敏度降低，同时分析时间过长，而基于高分辨质谱的分析无法实现人参皂苷的绝对定量。上述方法在同时量化多种皂苷成分时均有明显缺陷，不利于从整体揭示药材的化学特征。目前，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是复杂基质样品中多种微量目标物确认和准确定量的主流方法[16‒18]，通过多重反应监测模式，在不需要完全分离目标物的情况下实现定性定量检测，同时大大缩短分析时间，提高检测的灵敏度和数据质量的稳定性。笔者采用简单的甲醇超声提取处理方式，结合液相色谱-串联质谱快速、准确、专属性强的优势，建立了人参组培不定根中11种皂苷的含量测定方法，为人参的育种繁殖、资源利用提供技术保障。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪：6460型，配有AJS-ESI离子源，美国安捷伦科技有限公司。

台式高速冷冻离心机：CF16RXII型，日本日立公司。

多用途涡旋混合器：SAS型，英国Stuart公司。

超声波清洗器：KQ3200型，昆山超声仪器有限公司。

氮吹仪：MFV-24型，广州得泰仪器科技有限公司。

电子天平：Quintix型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

人参皂苷：Rg1，质量分数为98.5%，批号为110703-202235；Rg3，质量分数为99.5%，批号为110804-201504；Re，质量分数为96.0%，批号为110754-202129；Rb1，质量分数为95.1%，批号为110704-202230；Rb2，质量分数为93.8%，批号为111715-202104；Rb3，质量分数为96.5%，批号为111686-202306；Rd，质量分数为97.3%，批号为111818-202305；Rh2 (S)，质量分数为95.8%，批号为111748-202102，中国食品药品检定研究院。

人参皂苷：Rg2，质量分数为92.4%，批号为C0007325；Rf，质量分数为92.6%，批号为C0006815，曼哈格(上海)生物科技有限公司。

人参皂苷：Rc，质量分数为99.9%，批号为FS1617362，天津阿尔塔科技有限公司。

正丁醇、三氯甲烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

乙腈、甲醇；均为质谱级，美国赛默飞世尔科技有限公司。

人参组培不定根样品：北京斯诞安普科技有限公司。

实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Water BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为水，B相为乙腈，流量为0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution conditions

 

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源(AJS-ESI源)；电离方式：负离子；毛细管电压：4.0 kV；干燥器温度350 ℃；干燥器流量8 L/min；雾化器压力0.2 MPa；检测方式：多反应监测(MRM)模式；MRM监测离子对参数如表2所示。

表2   11种分析物质谱参数列表

Tab. 2   MS/MS determination parameters of 11 analytes

注：*为定量离子

 

1.3 标准溶液制备

单标储备液：分别准确称取11种皂苷标准品约10 mg (精确到0.01 mg)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，得到质量浓度均为1 000 μg/mL的单标储备液，于-20 ℃保存。

混合标准储备液：分别精密移取上述单标储备液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，摇匀，得质量浓度为10 μg/mL的混合标准储备液，于-20 ℃保存。

系列混合标准工作溶液：准确移取上述混合标准储备液适量，用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、5、10 μg/mL 6种浓度的系列混合标准工作溶液，临用前现配。

1.4 实验方法

1.4.1 样品处理

取人参组培不定根样品适量，粉碎并充分混匀，过250 μm筛。准确称取过筛后的样品粉末0.1 g (精确至0.001 g)，置于15 mL离心管中，精密加入70%(体积分数，下同)甲醇水溶液5 mL，涡旋混匀1 min，在60 ℃下加热超声提取60 min，冷却后称重用70%甲醇水溶液补足重量。以3 000 r/min离心10 min后，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，必要时稀释5倍，上机测定。

1.4.2 样品测定

按仪器参考条件设定，将系列标准混合溶液和试样溶液等体积进样测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以皂苷标准溶液的质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，以保留时间和相对丰度比同时定性，外标法定量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 样品处理条件的选择

2.1.1 提取溶剂的选择

在实验过程中，人参皂苷的提取效率是准确定量的关键。目前常用的提取溶剂包括甲醇、水、不同比例的甲醇水溶液和水饱和的正丁醇，其中水饱和的正丁醇也是现行药典规定的标准方法[9]。笔者通过研究发现，采用70%甲醇水溶液提取与水饱和的正丁醇提取结果基本一致，但检测的偏差较小，可能原因是水饱和的正丁醇提取过程涉及蒸干及复溶等步骤，复杂且容易引入误差。考虑到采用70%甲醇水溶液提取可以简化实验过程，降低能耗，因此选择该溶剂作为提取溶剂。70%甲醇水溶液提取与水饱和的正丁醇提取结果见图1。

图1   不同溶剂提取样品测定结果

Fig. 1   Determination results of samples extracted by different solvents

2.1.2 提取时间、温度的选择

在确定70%甲醇水溶液作为提取溶剂后，对影响提取效率的主要因素提取时间和提取温度进行了进一步考察。选择10、20、40、60、80 min 5个时间点，选择25、40、60、80 ℃ 4个温度条件。研究发现，Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Rf 5种皂苷在40 min后即可提取完全，而其他几种皂苷在60 min后提取较为完全，提取80 min后各种皂苷成分含量未有明显变化，最终选择60 min作为最佳提取时间(60 ℃条件下)，结果详见图2。通过对4个提取温度进行比较，随着温度的升高皂苷含量略有增加，60 ℃时达到峰值且结果稳定，同时60 ℃也是人参药材常用的干燥条件，因此选择皂苷提取温度为60 ℃。

图2   不同提取时间对应的样品测定结果（60 ℃）

Fig. 2   Determination results of samples corresponding to different extraction time （60 ℃）

2.2 色谱质谱条件的优化

2.2.1 色谱条件

人参皂苷大多含有由30个碳原子排列成4个环的甾烷类固醇核，是由糖和苷元相连而成的糖苷类化合物[13]。因其结构相似，同分异构体较多，色谱分离有一定困难。试验比较了正、负两种离子监测模式采集皂苷类成分，其中负离子的响应强度较高，且更易形成准分子离子峰；比较了负离子监测模式常用的乙腈-水、乙腈-水(含5 mmol/L甲酸铵)流动相体系，结果表明乙腈-水流动相体系的响应较高；同时细化梯度洗脱程序，以实现分离效果；考察了HPLC系统中常用的C18色谱柱Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，其中Waters BEH C18柱分离效果较好，理论塔板数较高，且化合物的峰形较尖锐，对于Rb2和Rb3两种较难分离的同分异构体能实现基线分离，最终色谱条件见1.2.1。11种皂苷化合物的提取离子流色谱图见图3。

图3   11种皂苷混合标准溶液的提取离子流色谱图

Fig. 3   Extraction ion chromatograms of mixed standard solutions of 11 saponins

2.2.2 质谱条件的优化

选择1.0 μg/mL混合标准溶液，采用安捷伦科技有限公司自带的Optimizer优化软件，通过两通进样方式对目标化合物进行质谱条件的摸索，主要包括母离子的选择、去簇电压的优化、碰撞能的优化和子离子的选择。笔者发现，皂苷类化合物因其相对分子质量较高，需要设置较大的去簇电压，去簇电压在175～200 V范围效果较好；11种皂苷分子(M)中，除Rh2容易形成加和羧基(M+COOH)的准分子离子峰，其他化合物都易形成减氢(M-H)的准分子离子峰；通过对质谱二级碎片裂解规律的解析，发现皂苷类结构容易断开脱水葡萄糖分子而形成一系列特征碎片离子，如人参三醇型皂苷(Rg1、Re等)容易产生质荷比637、475的碎片离子，人参二醇型皂苷(Rb1、Rc等)容易产生质荷比783、621的碎片离子。以Rg1的质谱碎片为例，其典型的碎片离子为637[M-H-(glc-H2O)]-、475[M-H-2 (glc-H2O)]-、179[glc-H]-等，具体质谱裂解规律见图4。选择相对分子质量较大且响应较强的碎片离子作为离子对进行定量试验；接着对11种皂苷化合物的碰撞能进行优化，皂苷类化合物均需要较高的碰撞能量产生稳定的碎片离子，从而实现仪器最优的灵敏度。最终确定的皂苷化合物质谱参数详见表2。

图4   负离子模式下Rg1的二级质谱图及质谱裂解途径

Fig. 4   MS/MS spectrum and mass fragmentation behavior of Rg1 in the negative ion mode

2.3 基质效应的考察

液相色谱-串联质谱检测复杂基质样品时，检测结果的准确性易受基质效应的干扰，为此考察了人参组培不定根样品的基质效应(ME)对皂苷类物质的影响。称取样品适量(约1.0 g)，以甲醇为提取溶剂，在80 ℃条件下索氏提取8 h，期间每隔2 h更换甲醇。回流后残渣于60 ℃烘干，得空白基质样品，经检测不含皂苷类成分。按照1.4.1方法提取空白基质样品，平行制备基质标准溶液和溶剂标准溶液，通过计算基质标准曲线(校准曲线)线性方程斜率和溶剂标准曲线(标准曲线)线性方程斜率之比来评价基质效应的程度。当ME为85%～120%时，表明基质效应在可接受范围内，在实际检测中可以忽略基质效应，反之则应考虑基质效应对实际检测的影响。11种皂苷成分的ME计算见表3，ME结果为87.8%～96.1%，表明人参组培不定根中基质效应不明显，在实际检测中可使用标准曲线进行定量检测。

表3   11种皂苷成分的基质效应

Tab. 3   Matrix effect results for 11 saponins

 

2.4 线性范围和检出限

采用HPLC-MS/MS法分别测定人参皂苷系列混合标准工作溶液，以目标物的色谱峰面积为纵坐标y，以目标物的质量浓度为横坐标x，绘制标准曲线。11种化合物在曲线线性范围内线性良好，相关系数均不小于0.995。当样品取样量为0.1 g，定容体积5 mL，以信噪比为3和10时的进样质量浓度点为仪器的最低检出含量和最低定量含量，最终计算方法的检出限、定量限详见表4。

表4   11种分析物的质量分数线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 4   Linear range, linear equation, correlation coefficient, LODs and LOQs of 11 analytes

 

2.5 样品加标回收试验率

取人参组培不定根样品一批，平行称量18份，每份称取约0.1 g，3个浓度水平分别加入质量浓度为10 μg/mL混合标准溶液100、400、1 000 μL，每个水平取样6次，按该方法进行测定，结果见表5。由表5可见，11种皂苷类物质的平均回收率为90.43%～97.82%，相对标准偏差(RSD)为1.93%～6.33%，满足微量物质的检测需求。11种皂苷标准溶液的多反应监测色谱图详见图5。

表5   11种分析物的样品加标回收试验结果

Tab. 5   Spiked recovery results of 11 analytes samples

 

 

 

图5   11种皂苷标准溶液的MRM色谱图

Fig. 5   MRM chromatograms of 11 standard saponins solution

2.6 实际样品测定

取北京斯诞安普科技有限公司提供的人参组培不定根样品6批次，按照该方法进行测定，结果见表6。由表6可以看出，人参组培不定根样品中各皂苷成分与种植人参中有明显差别，其中Rg3和Rh2两种成分显著高于种植人参，其他皂苷成分略低于种植人参，各批次均未检测到Rb3成分。表明组培技术培养的人参与种植人参在单体皂苷成分上有明显不同，可通过调整培养液、培养环境等手段进一步研究组培技术在人参培养中的应用。

表6   人参组培不定根样品中皂苷成分测定结果

Tab. 6   saponins results in the tissue culture roots of ginseng

 

 

 

3、 结语

 

利用液相色谱-串联质谱系统建立了人参组培不定根样品中11种皂苷类成分含量的检测方法。该方法操作简单、分析时间短，测定结果准确，适用于人参组培不定根中多种皂苷成分的测定，为组培技术在人参药材中的生产栽培、资源利用提供保障。

 

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引用本文： 董喆，王玉梅，孙姗姗，等 . 高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定人参组培不定根中11种皂苷成分［J］. 化学分析计量，2024，33（10）： 55. (DONG Zhe, WANG Yumei, SUN Shanshan, et al. Determination of 11 saponins in adventitious roots of ginseng tissue cultures by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 55.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 人参皂苷