摘 要： 建立高效液相色谱-串联四极杆质谱定量分析荔枝中降糖氨酸A和亚甲基环丙基甘氨酸两种降糖氨酸的测定方法。荔枝样品以90%乙醇为提取溶剂进行超声提取，离心取上清，氮吹后用水复溶。经丹磺酰氯衍生化后，采用Waters HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）进行分离，柱温为35 ℃，水（含0.1%甲酸）和乙腈为流动相，梯度洗脱，流量为0.3 mL/min。质谱采用电喷雾电离源，正离子扫描，多反应监测模式进行检测。两种降糖氨酸的质量浓度在0.01～0.50 μg/mL范围内与其色谱峰面积线性良好，相关系数均大于0.999，降糖氨酸A的检出限为0.05 mg/kg，亚甲基环丙基甘氨酸的检出限为0.08 mg/kg，加标回收率为81.4%～98.7%，相对标准偏差为3.2%～5.9%（n=6）。该方法操作简单，分析时间短，灵敏度高，准确可靠，为荔枝中降糖氨酸A和亚甲基环丙基甘氨酸两种降糖氨酸的测定提供了有效的技术手段。

 

关键词： 高效液相色谱-串联四极杆质谱法； 荔枝； 降糖氨酸A； 亚甲基环丙基甘氨酸

 

 

1995年开始，印度荔枝主要产区穆扎法尔布尔地区每年5～6月份陆续报道在儿童中发生一种原因不明的神秘脑病[1‒2]。2014年，这种疾病大爆发，390名患病儿童中，有122人死亡[3‒5]。调查发现，疫情发生在荔枝主要产区，病例从5月份开始出现，集中在6月份的荔枝成熟季节，到7月份陆续消失[6]。近些年，国内有报道吃荔枝能引起“荔枝病”[7‒8]。“荔枝病”是一种由于空腹时大量食用荔枝引发的“低血糖症”，已导致多名儿童死亡。

荔枝中所含的糖是果糖，必须经由人体转化为葡萄糖后，才能被吸收利用。如果过量食入荔枝，人体内的转化酶就会供不应求，过量的果糖无法转化成葡萄糖，荔枝还会刺激胰岛细胞释放大量胰岛素，引发低血糖反应。“荔枝病”患病者常伴有低血糖、癫痫症状甚至死亡，这可能与荔枝中含有降糖氨酸A(HGA)和亚甲基环丙基甘氨酸(MCPG)两种物质有关，这两种物质都属于环丙基氨基酸类[9‒10]。研究发现，环丙基氨基酸能促进胰脏分泌胰岛素，增强胰岛素受体的敏感性，同时还可以增加葡萄糖转运子2 (Glut-2)的含量，抑制某些代谢酶，影响其他能量物质转化成糖，甚至影响脂肪酸的氧化，导致肝脂肪变性。当人体内的糖原耗竭后，大脑就会因缺乏能量物质，发生低血糖性脑病[11‒13]。目前，国际上多采用液相色谱-串联质谱法测定荔枝中HGA和MCPG的含量[14‒17]，而国内有关上述两种物质的检测方法鲜有报道。考虑到两种目标化合物的相对分子质量较小，水溶性极强，在反相色谱柱上基本不保留，测定时易受荔枝中水溶性杂质的干扰，常规的液相色谱-串联质谱方法并不能够很好地满足检测需求，因此笔者采用衍生化方式，建立快速、准确、专属性强的方法检测荔枝中HGA和MCPG，对加强市场监管和保障人民群众健康起到积极的作用。

 

 

1、 实验部分

 

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪：6460型，配有AJS-ESI离子源，美国安捷伦公司。

台式高速冷冻离心机：CF16RXII型，日本日立公司。

多用途涡旋混合器：SAS型，英国斯图尔特公司。

超声波清洗器：KQ3200型，上海昆山超声仪器有限公司。

氮吹仪：MFV-24型，广州得泰仪器科技有限公司。

电子天平：Quintix型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

HGA：质量分数为98.8%，批号为ALT805459，天津阿尔塔科技有限公司。

MCPG：质量分数97%，批号为1-JRH-164-1，加拿大TRC公司。

乙腈、乙醇、甲酸；均为质谱级，美国赛默飞世尔科技有限公司。

丹磺酰氯：色谱级，美国默克公司。

碳酸钠、盐酸甲胺：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

荔枝、红毛丹样品：荔枝产地广州，红毛丹产地云南。

实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Water HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为0.1%(体积分数)甲酸溶液，B相为乙腈，梯度洗脱程序：0～5 min，20%→80%乙腈；5～7 min，80%乙腈；7～7.1 min，80%→20%乙腈；7.1～8 min，20%乙腈，流量为0.3 mL/min。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(AJS-ESI源)；电离方式：正离子；毛细管电压：3.5 kV；干燥器温度350 ℃；干燥器流量8 L/min；雾化器压力206.8 kPa；检测方式：多反应监测(MRM)模式；MRM监测离子对参数见表1。

表1   两种分析物质谱参数

Tab. 1   MS/MS determination parameters of the two analytes

注：*为定量离子

 

1.3 标准溶液制备

系列混合标准溶液：分别准确适量称取HGA、MCPG固体标准品，用去离子水溶解，配制成质量浓度均为100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃保存。分别准确移取上述两种单标储备液适量，用去离子水逐级稀释成质量浓度分别为100、200、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的系列混合标准溶液，临用前现配。

基系列基质混合标准溶液：取红毛丹可食用部分，粉碎并充分匀浆，混合均匀。分别称取匀浆后的试样1 g (精确至0.001 g) 6份，置于15 mL离心管中，各自精密加入100、200、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的系列混合标准溶液1 mL，按照1.4.1样品处理步骤处理，最终得到质量浓度为10、20、50、100、200、500 μg/L的系列基质混合标准溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 样品处理

取荔枝可食用部分，粉碎并充分匀浆，混合均匀。分别称取匀浆后的试样1 g (精确到0.001 g) 6份，置于15 mL离心管中，加入90%乙醇3 mL，涡旋混匀1 min，超声提取20 min，再用无水乙醇定容至10 mL，摇匀。以10 000 r/min离心10 min后，精密吸取上清液5 mL于另一支15 mL离心管中，氮吹浓缩至1 mL左右，用去离子水定容至5 mL，摇匀，作为样品提取液备用。

准确移取0.5 mL样品提取液，加入碳酸钠缓冲液(80 mmol/L，pH值为9.5) 0.5 mL，丹磺酰氯衍生化试剂(1.5 mg/mL，现用现配) 0.5 mL于3 mL EP管中，充分混合后，室温避光衍生反应20 min (期间摇晃1次)，再加入0.05 mL盐酸甲胺溶液(20 mg/mL)涡旋混合，终止反应。以10 000 r/min离心10 min后，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，上机测定。衍生物在4 ℃以下可避光保存72 h。

1.4.2 样品测定

按仪器参考条件设定，将系列基质混合标准溶液和试样溶液等体积进样测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以HGA和MCPG基质标准溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，外标法定量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 样品处理条件的选择

HGA和MCPG是两种非蛋白质氨基酸，易溶于水和乙醇中。同时，荔枝中又含有大量的多糖类和纤维组织，为最大程度提取目标化合物，减少干扰组分，研究选择90%乙醇进行提取。考虑到两种氨基酸相对分子质量较小，极性较大，不易在反相色谱柱上保留，因此选择丹磺酰氯试剂进行衍生化处理，衍生化原理详见图1。

图1   两种分析物的衍生化反应原理

Fig. 1   Principle of derivatization reaction of the two analytes

对两种降糖氨酸的衍生化条件进行了探索，选择碳酸钠缓冲体系分别为8.5、9.5、10.5三个pH值条件，选择25、40、60 ℃三个温度条件，选择10、20、30、40、60、120 min 6个时间点考察最优化的衍生化条件。最终发现目标化合物(质量浓度200 μg/L)在pH值为9.5、室温条件下，达到的响应峰值最高，且所需反应时间最短，20 min即可反应完全。不同衍生化时间的响应强度见图2。

图2   两种分析物不同衍生化时间响应强度对比

Fig. 2   Comparison of response intensity of two analytes with different derivatization time

2.2 色谱质谱条件的优化

考察了HPLC系统中常用的Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。结果表明，Waters HSS T3柱分离效果较好，理论塔板数较高，且化合物的峰形完好。另外，在流动相中加入0.1%甲酸能够提高目标物质离子化效率，从而增强化合物响应，因此在水相流动相中加入0.1%甲酸，增强目标物质灵敏度。两种目标物的色谱图详见图3。

图3   两种分析物基质标准溶液的总离子流图和MRM色谱图

Fig. 3   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of the two compounds standard solution

选择200 μg/L混合溶剂标准溶液，通过设置不同梯度的去簇电压和碰撞能，采用两通进样方式对目标化合物进行质谱条件的摸索，主要包括子离子的选择，去簇电压的优化和碰撞能的优化。研究发现，去簇电压对目标化合物的响应影响较小，而碰撞能对目标化合物的响应有一定影响。两种化合物均选择出四个子离子碎片，结合响应强度和碰撞能的优化，最终选择170.1的碎片离子作为定量离子，157.1的碎片离子作为定性离子，目标化合物优化后的质谱参数详见表1。碰撞能优化过程详见图4。

 

图4   两种分析物响应强度-碰撞能变化趋势

Fig. 4   The change trend of response intensity-collision energy of two analytes

2.3 基质效应的考察

根据经验，质谱检测易受基质效应的影响，从而影响检测结果的准确性。红毛丹俗称毛荔枝，和荔枝均属无患子科植物，两者属“近亲”关系。研究发现，红毛丹本底中未检出两种待测目标化合物成分，基质空白色谱图详见图5。

图5   红毛丹基质空白总离子流图和MRM色谱图

Fig. 5   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of rambutan matrix

红毛丹适合用作基质效应的考察对象，在进行定量测定时平行制备基质校准曲线和溶剂标准曲线，通过计算基质校准曲线线性方程斜率和溶剂标准曲线线性方程斜率之比，来评价基质效应的程度。计算公式：

ME = (k2/k1) × 100%

式中：k1——溶剂标准曲线线性方程斜率；

k2——基质校准曲线线性方程斜率。

一般来说，ME在85%～120%时，基质效应在可接受范围内，在实际检测中可以忽略基质效应；反之则应考虑基质效应对实际检测的影响，在实际检测中应采用基质校准曲线代替溶剂标准曲线进行准确定量。红毛丹基质中两种化合物的ME计算见表2。由表2可见，HGA和MCPG均存在一定的基质效应，在实际检测中应制备基质校准曲线进行定量检测。

表2   两种分析物的基质效应

Tab. 2   Matrix effect results for the two analytes

 

 

 

2.4 线性范围和检出限

采用HPLC-MS/MS质谱对荔枝中HGA和MCPG两种降糖氨酸类成分进行定量分析，以红毛丹为空白基质制作基质校准曲线，以目标物的色谱峰面积为纵坐标y，以目标物的质量浓度为横坐标x，绘制校准曲线。两种化合物在曲线范围内线性良好，相关系数均大于0.999。当实际样品取样量为1 g，定容体积为10 mL，以信噪比为3和10时的进样质量浓度点为仪器的检出限和定量限，最终计算方法检出限为HGA 0.05 mg/kg、MCPG 0.08 mg/kg；定量限为HGA 0.1 mg/kg、MCPG 0.2 mg/kg，见表3。

表3   两种分析物的线性方程、相关系数、线性范围和检出限、定量限

Tab. 3   Linear equation, correlation coefficient, linear range and detection limit, quantification limit of two analytes

 

2.5 样品加标回收试验率

取荔枝样品一批，平行称样6份，每份称取约1.0 g，分别作为低、中、高三个浓度水平的加标本底，三个浓度水平分别加入质量浓度为5 μg/mL混合标准溶液100、200、400 μL，每个水平取样3次，按该方法进行测定，结果见表4。由表4可见，两种降糖氨酸类物质的平均回收率为81.4%～98.7%，测定结果的相对标准偏差为3.2%～5.9%，满足痕量物质的检测需求。

表4   两种分析物的加标回收率结果

Tab. 4   Results of spiked recovery rates for two analytes

 

取荔枝样品10批次，按照该方法进行测定，结果为HGA含量水平为1.06～3.04 mg/kg，MCPG含量水平为0.26～1.04 mg/kg。对结果进一步统计发现，半成熟荔枝样品(偏绿)中两种降糖氨酸成分检测结果较高，而完全成熟荔枝样品(全红)中两种降糖氨酸成分检测结果较低，说明吃完全成熟荔枝水果可降低两种降糖氨酸对体内糖代谢的干扰。荔枝样品和加标色谱图分别见图6和图7。

图6   荔枝样品分析物的总离子流图和MRM色谱图

Fig. 6   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of litchi samples

 

图7   荔枝加标样品分析物的总离子流图和MRM色谱图

Fig. 7   Total ion chromatograms and MRM chromatograms of spiked litchi samples

 

3、 结语

 

利用HPLC-MS/MS液相色谱-串联质谱系统建立了荔枝中HGA和MCPG两种成分的检测方法，使用衍生化处理显著提高了待测物质的灵敏度和保留性，通过红毛丹基质标曲匹配样品中的基质效应，显著提高定量测定的准确性。该方法过程简便、分析时间短，测定结果准确，适用于荔枝中HGA和MCPG的测定，为“荔枝病”引起的低血糖研究提供有效的检测手段。

 

 

参考文献：

 

1 JOHN T J，DAS M，VASHISHTHA V M. Outbreaks of hypoglycemic encephalopathy in Muzzaffarpur，India：Are these caused by toxins in litchi fruit？［J］. Indian Pediatr，2016，53（5）：399.

 

2 PRIYANKA P. A child-killing toxin emerges from shadows：Scientists link mystery deaths in India to consumption of lychees［J］. Science，2015，348：15.

 

3 DAS M，JOHN T J. Lychee-associated acute hypoglycaemic encephalopathy outbreaks in Muzaffarpur，India［J］. Lancet Glob Health，2017，5（9）：e859.

 

4 SHRIVASTAVA A，KUMAR A，THOMAS J D，et al. Association of acute toxic encephalopathy with litchi consumption in an outbreak in Muzaffarpur，India，2014：A case-control study［J］. The Lancet Glob Health，2017，5（4）：e458.

 

5 JOHN T J，DAS M. Acute Encephalitis Syndrome in children in Muzaffarpur：Hypothesis of toxic origin［J］. Curr Sci India，2014，106：1 184.

 

6 刘莹.小儿荔枝病71例临床分析［J］.广西医学，2000，22（5）：1 038.

    LIU Ying. Clinical research of 71 cases of litchi disease in children［J］. Guangxi Med J，2000，22（5）：1 038.

 

7 许黎忠，林志海，程芳芳，等.荔枝中毒48例急诊救治分析［J］.福建医药杂志，2015，37（2）：50.

    XU Lizhong，LIN Zhihai，CHENG Fangfang，et al. Analysis of emergency treatment of 48 cases of litchi poisoning［J］. Fujian Med J，2015，37（2）：50.

 

8 SPENCER P S，PALMER V S. The enigma of litchi toxicity：An emerging health concern in southern Asia［J］. Lancet Glob Health，2017，5（4），383.

 

9 TRIPATHI J，BANDYOPADHYAY N，HAJARE S N，et al. Determination of tolerable dose of litchi fruit considering reported hypoglycin A and MCPG contents through biochemical and histopathological evaluations in mice［J］. Curr Sci India，2019，117（8）：1 292.

 

10 BLAKE O A，BENNINK M R，JACKSON J C. Ackee （Blighia sapida） hypoglycin A toxicity：Dose response assessment in laboratory rats［J］. Food Chem Toxicol，2006，44（2）：207.

 

11 LI D，AGNIHORTI G，DAKOJI S，et al. The toxicity of methylenecyclopropylglcine：Studies of the inhibitory effects of （methylenecyclopropyl）formyl-CoA on enzymes involved in fatty acid metabolism and molecular basis of its inactivation of Enoyl-CoA hydratases［J］. J Am Chem Soc，2002，121（39）：9 034.

 

12 ISENBERG S L，CARTER M D，GRAHAM L A，et al. Quantification of metabolites for assessing human exposure to soapberry toxins hypoglycin a and methylenecyclopropylglycine［J］. Chem Res Toxicol，2015，28（9）：1 753.

 

13 张钟，黄丽花，张玲，等.荔枝肉水溶性多糖降血糖作用［J］.食品科学，2013，34（15）：303.

    ZHANG Zhong，HUANG Lihua，Zhang Ling，et al. Hypoglycemic effect of water-soluble polysaccharides from litchi flesh［J］. Food Science，2013，34（15）：303.

 

14 ISENBERG S L，CARTER M D，HAYER S R，et al. Quantification of toxins in soapberry （Sapindaceae） Arils：Hypoglycin A and methylenecyclopropylglycine［J］. J Agric Food Chem，2016，64（27）：5 607.

 

15 YANG J L，ZHU X G，ZHANG P，et al. Detection of toxic methylenecyclopropylglycine and hypoglycin A in litchi aril of three Chinese cultivars［J］. Food Chem，2020，327：1.

 

16 SANFORD A A，ISENBERG S L，CARTER M D，et al. Quantitative HPLC-MS/MS analysis of toxins in soapberry seeds：Methylenecyclopropylglycine and hypoglycin A［J］. Food Chem，2018，264：449.

 

17 SANFORD A A，ISENBERG S L，CARTER M D，et al. Quantification of hypoglycin A and methylenecyclopropylglycine in human plasma by HPLC-MS/MS. J Chromatography B，2018，1 095：112.

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 降糖氨酸A 亚甲基环丙基甘氨酸