Ni-NTA是镍柱纯化常用的一种填料，镍柱纯化常指亲和层析，该方法利用组氨酸（His）残基上的咪唑基团与Ni2+之间能形成配位键的特性，实现对含有His-Tag（组氨酸标签）的目的蛋白的特异性吸附。

 

 

His-Tag是重组蛋白纯化中最常见的标签之一，其通过融合表达与目的蛋白相连，从而赋予目的蛋白与镍柱结合的能力。在层析过程中，杂蛋白因不带有His残基无法与Ni2+结合，从而实现了目的蛋白与非目的蛋白的有效分离。

 

操作步骤

① 准备工作：

 

（1）根据目的蛋白的性质，选择合适的镍柱类型和洗脱方式，配制合适PH值的缓冲液和洗脱液。

 

（2）缓冲液和洗脱液在蛋白纯化操作前用0.45 μm或0.22 μm滤头过滤除菌避免污染镍柱，减少寿命。

 

② 样品预处理：

 

预处理待纯化的蛋白样品，如离心去除杂质、调整样品的pH值、低浓度咪唑溶液透析以去除培养基中的EDTA和盐溶液等（具体操作需根据蛋白性质设计）。

 

③ 镍柱平衡及上样：

 

利用无咪唑或低浓度咪唑的缓冲液对镍柱进行平衡，待曲线维稳10 min左右，即平衡结束。平衡完成后，将处理完毕的样品缓慢且匀速地加入镍柱中，使目的蛋白与镍柱充分结合。

 

④ 除杂：

 

使用低浓度咪唑缓冲液（如2、5 、10、20、25 mM咪唑）冲洗镍柱，去除与镍柱非特异性结合的杂蛋白。该过程应合理控制流速和时间，以确保杂蛋白被完全去除。

 

⑤ 洗脱：

 

为收集高纯度的目的蛋白，使用含有高浓度咪唑的洗脱液将目的蛋白从镍柱上洗脱下来。通过梯度洗脱的方式，逐步增加洗脱液中咪唑的浓度（如50、100、200、300、400、500 mM咪唑）。在目的蛋白首次纯化实验中，应设置多个从低至高咪唑浓度的缓冲液，探索合适的洗脱条件。

 

⑥ 收集与分析：

 

收集含目的蛋白的洗脱液样品，利用SDS-PAGE电泳等方法对其进行分析以评估其纯度和浓度。

⑦ 清洗与保存：

 

使用ddH2O冲洗镍柱，并用20%乙醇溶液冲洗并保存镍柱以防止微生物生长。

 

注意事项

① 在实验前查询并了解目的蛋白的性质（分子量、等电点、氨基酸组成、聚体等），并严格控制实验条件，如缓冲液的pH值和咪唑浓度，以确保实验的准确性和可重复性。

 

② 严格按照说明书操作，并且样品在上柱前需要进行预处理（高速离心、调PH或透析等），以保护镍柱，避免污染和损伤。

 

③ 在镍柱的使用中，应避免缓冲液中存在还原剂和螯合剂，以免 Ni2+ 被还原而脱落。

 

④ 镍柱使用太久或脱镍，可进行镍柱再生或更换新的镍柱。

 

⑤ 尽量收集镍柱纯化过程中每一步产生的洗脱液，以便实验结束后利用SDS-PAGE等方法对蛋白纯化过程进行进一步分析。

来源：实验老司机

关键词： 镍柱