转染是细胞生物学研究的重要技术，是指将外源性的DNA、RNA等导入目的细胞的过程，主要用于调控基因表达，从而研究基因功能。以下以研究肾缺血再灌注损伤模型中慢病毒包装过表达肾小管上皮细胞（HK-2细胞）线粒体分裂基因drp1为例介绍转染相关实验步骤。

 

一、质粒提取（辅助质粒PMD2.G、PSPAX2，目的质粒）

 

实验步骤：

 

1、配制LB固体培养基（加氨苄）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加入1000 mL水。需高压灭菌，待温度降至40-50℃时，加入适量氨苄，混匀后倒板。

 

2、划线：待板中培养基冷却至室温后，将接种环用酒精灯灭菌后在酒精灯周围蘸取菌液并依次划线，然后置于37℃培养箱培养。

 

3、摇菌：挑去板中出现的单个菌落至装有15 mL LB液体培养基的离心管中，瓶盖适当拧松，置于37℃摇床上200rpm 12-16h。

 

4、离心：将含有菌液的离心管1000rpm，室温离心5min。

 

5、提取：弃去离心管中菌液，用质粒提取试剂盒进行质粒提取。

 

6、测浓度：用分光光度计测取各提取质粒浓度，用于后续实验。

 

注意事项：

 

1、配制LB固体培养基加入氨苄时，需控制好温度。温度过高，会使得氨苄失去活性；温度过低，则会使氨苄混合不均匀，且容易凝固。通常情况下，以手能握住玻璃瓶15s为宜。

 

2、常用氨苄浓度为100mg/mL，加入量为100μL/100mL。

 

3、LB固体培养基与液体培养基配制的区别在于是否加入琼脂粉。

 

4、划线通常采用四区划线法，每个区不能有重叠，首尾不能接触，逐渐稀释以便于长出所需的单个菌落。

 

5、划线时，注意不能划破琼脂培养基，以防止造成污染。

 

6、划线结束后，长出单个菌落即可挑菌，若菌落太小，可适当延长培养时间；若时间过长，可能导致交叉污染。

 

7、须挑取单个菌落，不可挑去多个单菌落，这样会导致提取的质粒纯度降低，进而影响转染效率。

 

8、摇菌时，不可时间过长，以12-16h为宜，太长可能会造成菌体变异；时间太短，会影响质粒提取效果。

 

二、转染步骤

 

实验步骤：

 

1、293T细胞准备：复苏293T于培养瓶中，观察293T状态至传代至少3次。传代后的293T长满后传至培养瓶中，继续培养并观察细胞状态。

 

2、换液：培养瓶中293T密度达70-80%时，提前1h换液。

 

3、转染复合物配制：A液：3μg PSPAX2 ；1.5 μg PMD2.G；3μg Target，用无血清DMEM培养基或Opti-MEM培养基补齐至1.5mL。B液：加入22.5μL PEI（1μg/μL）至1.5mL无血清DMEM培养基或Opti-MEM培养基。

 

4、静置：A,B液分别配好后，室温静置5min。

 

5、混合：将B液缓慢悬空滴加至A液，顺序不可反。

 

6、静置：混合后，室温静置20min。

 

7、转染：弃去293T培养瓶中的培养基，将上述混合缓慢加入293T细胞。

 

8、换液：6h后弃去混合液，换成293T细胞正常培养基培养。

 

注意事项：

 

1、转染前，要确保293T细胞状态，否则影响转染效率。

 

2、新复苏的293T状态欠佳，不利于转染，至少3代以后。

 

3、转染前293T密度不能过大，太满后续容易飘；密度过低则影响产毒效率。

 

4、转染复合物配制因细胞系及自身经验可能不同。

 

5、加入B液时，必须缓慢滴加。

 

6、换液时，动作要轻柔，不可对着293T细胞。

 

三、病毒收集

 

实验步骤：

 

1、24h收集病毒：换液后24h收集病毒至15ml离心管中，并更换新的培养基（含血清不含双抗DMEM培养基），并将收集到的病毒置于4℃。

 

2、48h收集病毒：48h后再次收集病毒至上述离心管中，置于4℃冰箱。

 

3、配制病毒浓缩液：即5× PEG 8000，NaCl 8.766g+PEG 8000 50g，溶于200mL纯水，高温高压灭菌，保存于4℃。

 

4、离心：将收集到的病毒4℃，3000rpm，离心15min，去除细胞碎片。

 

5、过滤：用注射器吸取上清，用0.45μM滤膜过滤至15mL离心管中。

 

6、浓缩：用移液枪吸取PEG8000，向病毒液中加入1/4体积的5× PEG8000，并立即颠倒混匀，置于4℃。每30min颠倒5-10次，总共操作5-6次。

 

7、静置：于4℃静置过夜，白色沉淀物即为病毒。

 

8、离心：4℃，4000g，离心20min。

 

9、重悬：弃去上清，用适量冷PBS或无血清DMEM培养基重悬，并分装至1.5mL EP管中。

 

10、存放：将分装好的病毒液放至-80℃冰箱保存，或者用于后续实验。

 

注意事项：

 

1、收集病毒时，含血清不含双抗的培养基产毒效率较高。

 

2、两次收集的毒液可混合，也可分开，一般48h产毒较多。

 

3、离心机离心前，均需预冷。

 

4、弃上清时，动作要轻柔，避免吸到病毒。

 

四、感染目的细胞

 

实验步骤：

 

1、准备HK-2细胞：将生长状态较好的HK-2细胞传至新培养瓶中，观察细胞状态及密度。

 

2、换液：待HK-2细胞密度为50-70%时，给细胞换液。

 

3、加毒：向病毒液中加入ploybrene ，混合后加至目的细胞中，并使ploybrene终浓度达8μg/mL，混匀后放入培养箱培养。

 

4、换液：24h后，更换新的DMEM-F12培养基（含血清+双抗）。

 

5、筛选：继续培养24h后，进行带抗性的稳转株筛选。

 

6、验证：用荧光显微镜或WB、PCR验证效果。

 

注：由于篇幅有限，步骤5、6本文不作详细讲解。

 

注意事项：

 

1、感染前，要确保目的细胞活性及密度。

 

2、Ploybrene浓度因细胞系及经验不同可能不同。

 

3、待细胞活性恢复后，再进行筛选。

 

4、若有荧光对照，可根据荧光判断转染的效率；但HK-2细胞系的drp1过表达效果还需WB、PCR等做进一步验证。

来源：实验老司机

关键词： 基因过表达实验