DNA提取的目的是从细胞或组织中分离并纯化DNA。通常包括细胞裂解、去除蛋白质和其他杂质、以及DNA的沉淀和纯化。

 

一、离心柱法提取DNA步骤

 

1）将组织或细胞悬液加入裂解缓冲液，涡旋混匀。裂解缓冲液中含有变性剂（如胍异硫氰酸盐），可以有效地裂解细胞和组织，破坏细胞膜和细胞核膜，同时使核酸与蛋白质分离。

 

2）将裂解液转移到DNA Spin Column中，离心收集流穿液。这个步骤涉及到将裂解液通过一个特殊的膜过滤，该膜具有特定的孔径，允许小分子如RNA和蛋白质通过，而DNA由于其较大的分子尺寸被截留在膜上。

 

3）用Washing Buffer洗涤DNA柱膜。Washing buffer中含有乙醇和盐，可以去除杂质和蛋白质，保留DNA在柱膜上。 

 

4）将Elution Buffer加入到柱中，离心收集纯化的DNA。Elution Buffer是低盐缓冲液，能有效洗脱柱膜上结合的DNA，得到纯化的基因组DNA。因为DNA在低盐条件下更容易溶解。离心后，收集纯化的DNA到一个新的收集管中。

 

5）提取完成后，使用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，通过测定260nm和280nm的吸光度比值来评估DNA的质量和蛋白质污染情况。

 

6）纯化的DNA应妥善存储于-20°C或更低的温度下，以保持其稳定性和防止降解。

 

二、根据目标基因序列设计PCR引物

 

在成功提取并纯化了目标基因的DNA后，下一步是设计PCR引物，以便进行目标基因的扩增。合理设计的引物可以确保PCR反应的特异性和效率。设计PCR引物时需考虑以下原则：

 

1）引物的长度为18-25bp，引物过短可能导致非特异性结合，引物过长可能导致退火效率低。

 

2）理想的GC含量在45%-55%之间。

 

3）避免引物内部和引物之间形成二级结构（如发夹结构）和二聚体。

 

4）引物的3'端应避免过多的G或C，因为这可能导致非特异性扩增。

 

5）对于基因组DNA，引物不应设计在跨越内含子的区域，以避免扩增非编码区域。

 

6）引物的3'端不应有过多的连续相同碱基，以减少3'端退化现象。

 

三、电泳鉴定

 

1）使用PCR扩增特定的DNA片段。PCR体系：10μL SYBR+ 0.5μL Forward Primer+0.5 μL Reverse Primer+ 1μL 模版DNA+8μL DEPC

 

2）称取0.3g琼脂糖，加入30mL TAE缓冲液。搅拌均匀后，用锡纸封口。将锥形瓶放入微波炉加热30秒，直至琼脂糖完全溶解，呈现透明无颗粒状态。待溶液冷却至45℃，加入1.5µL核酸染料，轻轻混匀。

 

3）将溶液倒入提前洗净晾干的制胶板中，厚度为0.3-0.5cm。插入制胶梳，确保胶中无气泡，静置30分钟待胶凝固，小心拔掉梳子。琼脂糖凝胶用于分离不同大小的DNA片段。TAE缓冲液维持电泳过程中适当的pH和离子强度。核酸染料如溴化乙锭嵌入DNA分子中，使其在紫外光下发光，从而可以显影DNA条带。

 

4）将凝胶连同胶托放入电泳槽正中央，有胶孔的一侧朝向负极。在电泳槽中倒入TAE缓冲液，刚好淹没凝胶。在10µL样品中加入2µL loading buffer，混合后加入胶孔中，加入5µL marker。Loading buffer含有溴酚蓝和二甲苯氰，作为电泳指示剂，显示电泳进程，便于适时终止。甘油增加样品密度，使样品沉降到点样孔中。

 

5）盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电压100V-150V，运行30分钟-1小时。电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统拍摄。在电场作用下，带负电荷的DNA分子从负极向正极迁移。较小的DNA片段迁移得更远。

 

6）电泳结束后，使用紫外光源观察染料标记的DNA条带，并通过凝胶成像系统拍摄记录结果。

 

四、实验结果展示 

 

 

上述是笔者自己做的DNA琼脂糖凝胶电泳图，左侧是Marker（100bp-1500bp），右侧是条带的位置反映了DNA片段的大小。较小的DNA片段移动距离较大，位于下部；较大的DNA片段移动距离较小，位于上部。条带清晰、明确，表明DNA样品纯度高。如果有拖尾或弥散条带，可能表明DNA降解或样品中含有杂质。

 

五、注意事项

 

1）在处理多个样本时，使用单独的离心管和离心柱，避免样本之间的交叉污染。

 

2）设置合适的电压，过高的电压可能导致凝胶过热或DNA条带扭曲。

 

3）在电泳过程中和电泳结束后，避免凝胶干燥，这会影响DNA条带的清晰度。

 

 

来源：实验老司机

关键词： DNA提取 电泳