细胞系基因敲低常见的方法包括：shRNA、siRNA、CRISPR/Cas系统及sgRNA，我主要分享shRNA敲低细胞系表达的方法，其大致原理为将shRNA连接到PLKO的质粒中，将质粒转染进细胞，在细胞质中，质粒可以转录出一段与目的基因互补的单链RNA，这条互补RNA与目的基因的mRNA互补结合后，会特异性的将目的基因的mRNA降解，从而使目的基因翻译的模板减少，达到敲低目的基因的效果。

 

主要的方法步骤如下：

 

1.shRNA序列设计：

 

shRNA可在网页在线设计，设计完成后送至公司合成。

 

2.shRNA序列退火

 

1)将公司合成的shRNA序列常温4000rpm离心1min，按包装管上的指示加入相应微升的超纯水到相应的浓度，根据实验所需取部分稀释到10μmol。

 

2)水浴锅提前设置到95℃，退火体系50μL按下表依次加入相应试剂，95℃退火4min。

 

 

3)退火完成后，等待水温自然冷却至手温后，可将退火后的shRNA放入冰箱4℃暂存。

 

注意：shRNA合成后一般为粉末状，合成公司不同处理方式不同，根据说明书处理即可。

 

3.双酶切敲低载体PLKO

 

酶切位点的选择提前进行查询，常见酶切体系如下，37℃酶切1h。

 

 

4.琼脂糖凝胶鉴定酶切结果

 

根据载体大小配置琼脂糖凝胶并跑电泳，根据酶切片段计算片段出现的位置，以此判断载体酶切是否成功，可能出现的结果如图所示：

 

 

5.胶回收（根据回收试剂盒的操作步骤进行即可）

 

6.shRNA和酶切后的载体连接

 

连接体系10 μL，按下表依次加入相应试剂，振荡混匀并离心，16℃连接4 h或过夜。

 

 

连接结束后将样品放入冰箱4℃暂存。

 

7.连接产物转化、摇菌、测序

 

连接产物转化摇菌及提质粒均按常规步骤操作即可，质粒提取结束根据浓度取一定微升的原液送公司测序，查看载体构建是否成功。

 

8.慢病毒包装、筛选

 

1)提前一天在6 cm培养皿中铺HEK-293T细胞，保证第二天密度可达70%左右。

 

2)准备相应数量的高压后的Ep管，加入慢病毒包装质粒4 μg（PSA 3μg +PMD2G 1μg）、4 μg测序正确的质粒和200 mL Opti-MEM混匀（单个质粒），再加入24 μL PEI，轻轻混匀，室温静置10 min。

 

3)将提前一天铺好的293T细胞换液，换成10% FBS转染培养基1.5 mL，注意小心操作，尽量避免细胞悬浮。

 

4)静置10 mins后，每Ep管中加入1 mL 10%FBS转染培养基，轻轻混匀，将其全部轻轻加入培养皿中，4 h后换完全培养基 6mL。

 

5)转染40 h后小心收集病毒上清，使用0.22 μm的过滤网进行过滤，过滤完成后冰箱4℃可短暂保存。

 

6)待构细胞提前一天使用6孔板铺板，保证感染前细胞密度达60%以上，同时应选用状态最好的细胞。

 

7)小心吸掉待构细胞6孔板中的原培养基，加入4 mL含嘌呤霉素（由载体本身决定）的细胞的培养基（嘌呤霉素终浓度为1.5 μg/mL），加入PBS浓度梯度稀释好的病毒液，十字混匀后放入细胞培养箱。

 

8)6孔板每两天换一次含嘌呤霉素的培养基2 mL，大约筛选一周对照组细胞死亡，稳转细胞成型。

来源：实验老司机

关键词： RNA 细胞系基因敲低实验