实验原理：

 

Pull-down实验是一种常用于研究蛋白质相互作用的技术。其基本原理是利用蛋白质之间的特异性相互作用来筛选和鉴定与感兴趣蛋白相互作用的蛋白质。在实验中，首先将感兴趣的蛋白质（通常是已知的蛋白质）与特定的标签（如GST、HIS等）融合，并表达在宿主细胞中。然后，将这些标记蛋白与细胞提取物或重组蛋白混合，使它们在体外环境中进行相互作用。

 

在混合过程中，与标记蛋白质相互作用的其他蛋白质会结合到标记蛋白质上形成复合物。未结合的蛋白质被洗脱，留下与标记蛋白质相互作用的蛋白质。最后，通过分析技术（如Western blotting、质谱分析等），可以鉴定和定量与标记蛋白质相互作用的蛋白质，从而揭示它们之间的相互作用。

 

Pull-down实验的基本原理是基于蛋白质之间的特异性和亲和性相互作用。通过选择适当的标签和实验条件，可以准确地研究感兴趣蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，从而深入了解这些相互作用在细胞功能中的作用机制。

 

 

Pull-down验证蛋白互作原理图

 

实验步骤：

 

1、构建载体

 

在进行载体构建时，通常会用常见的蛋白质标签，如GST（谷胱甘肽S-转移酶）、HIS（组氨酸富集标签）、MBP（麦芽糖结合蛋白）等。这些标签对应着多种载体，常见的有PET系列（如pET-28a）和PGEX系列载体（如pGEX-4T1）。

 

2、检测蛋白表达

 

1）将构建好的载体转化到BL21大肠杆菌菌株。

 

2）将BL21菌种进行扩大培养，待细菌培养至OD值达到0.6-0.8时，加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），以诱导蛋白表达。

 

3）诱导结束后，收集菌体并加入PBS缓冲液，然后使用超声破碎仪进行细胞破碎。

 

4）破碎后，12000r离心，收集细胞上清，并加入5×Loading buffer，煮10分钟。

 

5）通过Western blot技术检测蛋白表达效果。

 

3、蛋白大规模培养及纯化鉴定

 

经过上述蛋白表达预实验，确定了适宜的IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度后，可以进行蛋白的大规模培养。

 

1）收集全部培养上清，如果目标蛋白带有GST标签，可以利用GST成品纯化柱进行纯化处理。

 

2）考马斯亮蓝染色：取2微克GST-A和HIS-B蛋白，加入适量5×loading buffer，进行100℃煮沸10分钟，然后进行蛋白电泳。

 

3）蛋白电泳结束后，切割凝胶，并加入考马斯亮蓝染色液，过夜染色。

 

4）用脱色液脱色凝胶，清洗，直到背景清晰，拍照留存。

 

4、Pull-down实验

 

1）安装柱子并用PBS平衡柱子。

 

2）向一个封闭的GST柱子中加入2毫升的GST-A，并在4℃下旋转混合6小时。

 

3）流出孵育液，用已预冷的350毫升1×PBS洗涤GST柱子约15次（每次加入10毫升PBS后，盖好盖子颠倒混匀，然后打开流出），保持在4℃。

 

4）在GST-A孵育的柱子中吸取50微升的介质，加入5×loading buffer后煮沸10分钟，作为Input，4℃备用，用于检测GST-A是否成功挂在柱子上。

 

5）向柱子中加入2毫升的HIS-B，在4℃下过夜孵育，并取50微升的蛋白作为HIS-B，加入loading buffer后煮沸10分钟作为质控，4℃备用。

 

6）流出孵育液后，用预冷的1×PBS洗涤柱子约15次。

 

7）取50微升的介，加入5× loading buffer后煮沸10分钟，4℃备用，用于检测HIS-B蛋白是否与GST-A蛋白发生相互作用。

 

结果分析：

 

1）考马斯亮蓝检测

 

2）Western blot验证

 

注意事项：

 

1）由于不同的蛋白在不同载体上的表达效果各异，有些可能会表达在包涵体中，导致难以纯化。因此，有时需要对载体进行改造，以促进蛋白的溶解和表达。在这个过程中，需要进行不同的载体构建尝试，以寻找最适合的表达条件。

 

2）在诱导过程中，需要设置不同浓度的IPTG（如0.3、0.5、0.7等）、不同诱导时间（可暂定为16小时或12小时等）以及不同的诱导温度（如28℃或16℃等），以寻找最佳的表达条件。

 

3）离心过程中的转速也会影响蛋白表达情况，因此需要确定一个合适的转速。

 

4）在准备细胞裂解液时，需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。

 

5）在所有步骤中，尤其是蛋白相互作用和洗脱步骤中，应该保持低温，通常在冰上进行，以防止蛋白的非特异性结合降解。

 

 

来源：实验老司机

关键词： Pull-down实验