引物是一种短的DNA或RNA序列，用于在PCR（聚合酶链式反应）和其他分子生物学技术中扩增和检测特定的DNA或RNA序列。

 

引物通过与目标序列的互补碱基配对来定向扩增所需的DNA或RNA片段。在分子生物学研究中，引物的设计是非常重要的一步，因为它直接影响到PCR扩增的特异性和灵敏度。

 

一、普通PCR与荧光定量PCR引物设计上的相同注意点

 

1.序列的查找是一致的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，序列选取应在基因的保守区段，选择合适片段长度

 

2.引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度太高，不适合 DNA 聚合酶进行反应

 

3.3’端最好不要有A，5’端可以容忍二聚体，但3’端一定不要有二聚体

 

4.不要有连续的GGG 或CCC、GCGC、CGCG之类，不要有错配，前后引物的退火温度要差不多，差异在2度以内

 

5.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

 

6.Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%

 

7.引物之间的TM相差避免超过2℃

 

8.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基，引物3'端要避开密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

 

9.引物的设计好后使用Blast 验证

 

各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；

 

用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

 

如果实在满足不了这么多要求，那么就：

 

1、引物与模板配对好；

 

2、两个引物退火温度差不多；

 

3、每个引物的 GC 含量不要太高或太低；

 

4 、引物最好没有回文序列；

 

就这 4 点就很好了。如果还是满足不了！只要前2点就够了。

 

二、荧光定量引物的特定要求

 

做荧光定量PCR时，用SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。

 

荧光定量PCR引物设计的要求：

 

1、避免重复碱基，尤其是 G.

 

2、引物的退火温度要高，一般最好要在 60 度以上；

 

3、GC含量40-60%.

 

4、3'端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.

 

5、正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

 

6、引物的产物大小不要太大，80～150 bp 最为合适。

 

三、引物设计后的NCBI BLAST引物验证

 

BLAST 的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列；

 

如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

 

以HSP70为例

 

F:ATGTTGCTCTCTCCAAGAATAACGTT

 

R:TCAGTTCTTCTCCTCCTTCTTTTCCTG

 

1、未克隆全长序列

 

方法一

 

(1)

 

 

(2)

 

 

(3)

 

 

 

(4)

 

 

(5)

 

 

方法二

 

(1) 

 

引物中间空一格

 

 

 

(2)  

 

数据库选nr比较全面

 

选择你物种的拉丁学名

 

 

 (3)  

 

相似比较

 

 

 (4)  

 

一一对应直线,即为完全匹配

 

2、克隆全长序列

 

>HSP70表示该序列名称

 

>+名称

 

(1)  

 

(2)  

 

(3)  

在本条序列中引物特异性较好

 

参考资料：

 

https://www.labmanager.com/benefits-of-electronic-pipettes-533

 

https://www.snapgene.com/guides/polymerase-chain-reaction

 

 

来源：实验老司机

关键词： 引物设计