中和抗体效价测定通常使用病毒中和试验（Neutralization Assay）来评估抗体对特定病毒的中和能力，常见的方法包括传统的病毒中和实验（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）、基于细胞病变的中和实验（Cytopathic Effect Neutralization Assay, CPE assay）以及荧光中和实验（Fluorescent Neutralization Assay, FNA）。以下是一般的实验流程，以FNA为例：

 

 

一、实验材料准备

 

1.细胞株：选择合适的宿主细胞，接种到48孔板中，培养至汇合度约为60%。

 

2.病毒：准备实验使用的病毒株，确定感染剂量（通常使用已知TCID50的病毒）。

 

3.抗体：实验组为待测血清或抗体溶液，阴性对照组为无抗体的培养基或溶液。

 

4.培养基：含有适当血清浓度的DMEM或MEM。

 

二、血清/抗体稀释

 

将待测血清或抗体按梯度稀释（如1:10、1:100、1:1000等），每个稀释度的抗体分别加入到不同孔中。

 

 

三、病毒与抗体孵育

 

1.取等体积的病毒液和不同稀释度的抗体混合。

 

2.在37°C条件下孵育1小时，使抗体与病毒结合。

 

四、细胞感染

 

1.将病毒-抗体混合物加入96孔板中的已汇合细胞。

 

2.在37°C、5% CO₂环境下孵育1小时，促进病毒感染细胞（可根据不同病毒与细胞的特点改变相关条件）。

 

3.吸掉未结合的病毒-抗体混合物，加入2%FBS培养基继续培养12-48小时（具体时间取决于病毒的复制周期）。

 

五、固定与染色

 

1.培养结束后，弃去培养基，使用4 %多聚甲醛固定细胞10-20分钟。

 

2.用PBS冲洗细胞3次，每次5分钟，确保去除残余固定液。

 

3.加入封闭液（如1% BSA）封闭细胞表面非特异性结合位点，室温孵育30分钟。

 

六、荧光标记

 

1.用荧光标记的抗病毒抗体孵育细胞，室温下孵育1小时或4°C孵育过夜。

 

2.孵育后，用PBS冲洗3次，去除未结合的荧光抗体。

 

七、结果读取

 

1.使用荧光显微镜或荧光读板仪检测荧光信号。阳性对照（无抗体组）显示病毒感染的荧光信号，而不同稀释度的抗体组显示荧光强度的减少。

 

荧光显微镜先被PEDV感染的Vero细胞，荧光染料为FITC

 

2.根据荧光强度的降低程度，可以确定抗体对病毒感染的抑制效果。

 

八、数据分析

 

根据抗体稀释度与荧光信号强度之间的关系，绘制中和曲线，计算中和抗体效价。通常使用50%中和效价（NT50），即能够中和50%病毒感染的抗体稀释度。

 

1.数据归一化：

 

首先，将最大病毒感染（没有抗体的对照组，0%中和）的荧光信号作为100%，没有病毒的空白对照（0%感染）作为0%。

 

2.使用公式计算每个稀释度下的中和百分比：

 

 

例如，未添加抗体组的荧光信号是5000，某个抗体稀释度下测得的信号是3000，则该稀释度的中和百分比为20%。

 

3.绘制中和曲线

 

横轴（X轴）表示抗体稀释度（通常采用对数刻度，如1:10、1:100、1:1000等）。纵轴（Y轴）表示中和百分比（从0%到100%）。绘制每个稀释度对应的中和百分比，得到一条中和曲线。中和曲线通常呈现S形，低稀释度时中和率接近100%，高稀释度时中和率接近0%。

 

4.计算50%中和效价（NT50）

 

（1）找到50%中和点：

 

根据绘制的中和曲线，找到中和率为50%时的点。

 

通过插值法在曲线中找到对应的抗体稀释度。比如，如果在1:100的稀释度下中和率为50%，那么NT50就是1:100。

 

（2）使用非线性回归拟合曲线（此步骤根据不同实验需求而定）：

 

为提高精确度，可以使用非线性回归（如四参数逻辑回归，4PL）拟合中和曲线。计算出50%中和效价的精确稀释度值。

 

该方法通过拟合曲线的形式更为准确地找到NT50。

 

荧光中和实验的优势在于其灵敏度高、定量准确，适用于多种病毒和抗体的中和检测，特别是在研究抗病毒药物或疫苗时能提供定量数据。

来源：实验老司机

关键词： 荧光中和实验 中和抗体效价