一、细胞周期

 

细胞周期反映了细胞增殖速度。在这个过程中，细胞的DNA复制并加倍，在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。在细胞周期的不同时相，包括G1/G0期(2C DNA)、S期(介于2C~4C之间)和G2/M(4C DNA)，DNA含量存在差异，用DNA染料(PI是最经典的)进行染色，染料的荧光强度与DNA含量成正比，从荧光强度的变化，可以判断细胞所处的细胞周期时相。结合每个周期时相的细胞数目，可以判断各时相细胞所占百分比，从而判断细胞周期状况。

 

 

 

1.材料 

 

肿瘤细胞系、15ml 管、EP管、吸头、移液器和400目滤网试剂乙醇、胰酶、1XPBS、细胞周期试剂盒。

 

2.实验步骤

 

①制备单细胞悬液：

 

1）使用长满细胞的10厘米培养皿。

 

2）收集上清至15毫升离心管中。

 

3）用1XPBS洗涤一次，再次收集至15毫升离心管中。

 

4）加入1毫升胰酶，静置4分钟，在显微镜下观察细胞消化情况。当细胞形态变为圆形时，加入胰酶至15毫升离心管中。 

 

5）轻轻拍打皿底，帮助细胞从表面脱落，形成单细胞悬液。

 

6）加入1XPBS将细胞收集至15毫升离心管中。

 

7）以1500 rpm离心5分钟，弃去上清液。

 

②周期染色：

 

1）加入500μL 1XPBS液，使1x106细胞悬浮于15ml离心管中。

 

2）缓慢加入冰冷的无水乙醇至2ml，最终浓度达到75%，并在4°C保存过夜。

 

3）以1500 rpm离心5分钟，弃去上清液。

 

4）加入1ml 1XPBS，悬浮细胞，再次离心洗涤1遍。

 

5）弃去上清液，加入300μL  PI/RNase染色液，混匀后在避光条件下室温染色15分钟。使用400目筛网过滤单细胞悬液。

 

6）上机检测

 

7）Modifit软件模拟检测结果

 

3.实验结果解读

 

 

上图是笔者自己做的流式周期实验

 

X轴（FL2-A PE-A）表示荧光强度，反映DNA含量。Y轴（Number）表示细胞数量。

 

G1峰（深红色区域）：左侧的高峰，表示处于G1期的细胞，占总细胞的65.71%，对应的荧光强度为32.42。这是因为G0/G1期的细胞DNA含量较少（相对于G2/M期），因此荧光强度较低。 

 

G2峰：右侧的次高峰，表示处于G2期的细胞，占总细胞的4.96%，对应的荧光强度为62.51。G2/M期的细胞荧光强度最高，因为其DNA含量是G1期的两倍。

 

S期区域（斜纹蓝色区域）：G1和G2峰之间的区域，表示正在进行DNA复制的细胞，占总细胞的29.33%。

 

二、细胞凋亡

 

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，其外翻是细胞凋亡早期的一个关键信号，使得细胞表面发生分子组成的变化，从而被免疫系统识别和清除。AnnexinV是一种分子量为 35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能够高亲和力地结合到PS上，其结合不依赖于细胞是否处于凋亡状态，因此它能够标记所有PS外翻的细胞，包括早期凋亡细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种荧光核酸染料，能够结合到DNA和RNA上。由于其分子较大，无法穿透活细胞的完整细胞膜，因此只能进入膜完整性受损的细胞，如凋亡中晚期和坏死细胞。

 

通过使用荧光标记的Annexin V（如Annexin V-FITC）与PI的联合染色，可以在流式细胞仪上同时检测PS的外翻和细胞膜的完整性，从而区分活细胞、早期凋亡细胞、中晚期凋亡细胞和坏死细胞。

 

 

1.材料 

 

肿瘤细胞系、FALCON 管、EP管、吸头、移液器和400目滤网，胰酶、1XPBS、凋亡试剂盒

 

2.实验步骤

 

①具体分组：

 

对照组（未经过任何处理的正常细胞，作为实验的基线数据）

 

实验组（根据实验设计，可能会有多个实验组，每个组都经过特定的处理，如药物处理、辐射、基因敲除等）

 

单染组（分别使用Annexin V和PI单独染色，用于流式细胞仪的补偿调节和确定染色的特异性）

 

未染色组（未进行任何染色的细胞，用于确定细胞的自发荧光水平）

 

②制备单细胞悬液：

 

与上述细胞周期收集单细胞悬液操作相同。

 

③凋亡检测的染色(FITC/PI双染试剂盒)：

 

1）将细胞悬浮于500μL 1X Binding Buffer中，均匀分装4到个离心管中（每管1 X 106细胞），包括未染色管、FITC单阳管、PI单阳管，FITC_PI双阳管。在管子上进行标记，并放置于冰盒中。

 

2）在FITC单阳管，FITC_PI双阳管中分别加入5μl Annexin V-FITC。

 

3）在PI单阳管，FITC_PI双阳管中分别加入5μl PI后轻轻混匀。

 

4）在室温避光条件下孵育15分钟。

 

5）将所有实验管中加入200μl 1X Binding Buffer。

 

6）使用400目筛网过滤单细胞悬液。

 

7）上机检测。

 

4.实验结果解读

 

 

Annexin V-FITC单阳性细胞（Q3）为早期凋亡细胞。Annexin V-FITC和PI染色双阳性的细胞（Q2）为坏死细胞或者晚期凋亡。PI单染色阳性（Q1）为裸核细胞，即发生机械损伤的细胞。Annexin V-FITC和PI染色双阴性的细胞（Q4）为正常细胞。

来源：实验老司机

关键词： 流式细胞术