引言

在医学领域，骨缺损修复是一个长期困扰患者和医生的难题，尤其是那些因肿瘤切除、感染、外伤等造成的超过一定大小无法自然愈合的缺损，往往需要复杂的治疗方法。传统的治疗方法往往效果有限，且存在诸多局限性。然而，随着科技的进步，一种新的方法正在为这一难题提供解决方案——利用纯天然丝素蛋白（SF）通过冷冻铸造技术制成具有皮质骨样层状结构的3D支架。展现出了强大的修复大型骨缺损的能力，甚至无需添加生长因子，就能在猪模型上实现骨再生，这项技术或将成为骨缺损患者的福音！近期，相关工作以题为“Oriented Cortical-Bone-Like Silk Protein Lamellae Effectively Repair Large Segmental Bone Defects in Pigs”的文章发表在材料领域知名期刊《Advanced Materials》。

 

灵感来源于大自然的设计

当骨缺损超过临界大小时（如严重车祸或肿瘤切除后），骨组织无法自然愈合，形成大段骨缺损（LSBD）。LSBD的修复是骨科手术中的一个重大挑战，因为现有的治疗方法，如自体或异体骨移植、牵张成骨和骨膜诱导成骨等，都存在一定的局限性。这些方法可能面临来源有限、需要多次手术、增加手术创伤和疼痛以及严重免疫排斥风险等问题。组织工程疗法作为一种新兴的治疗手段，利用人工3D生物材料模拟细胞外基质（ECM）的性质，为骨缺损修复提供了新的思路。然而，这些材料的孔隙连通性差，与天然骨组织的微结构差异显著，导致细胞招募、血管化、体内降解和成骨诱导不足。因此，开发一种具有天然骨组织类似微结构的3D支架，成为骨组织工程领域的一个重要研究方向。

 

研究团队使用全蚕丝蛋白——从蚕茧中提取的SF，通过冷冻铸造技术一体化构筑骨修复支架材料，具有皮质骨类似的层状结构，模仿了人体骨骼中的哈弗斯系统，该系统由多层平行排列的骨板构成，能够在体外为细胞的生长和骨组织的再生创造了绝佳条件。研究团队发现，使用丝素蛋白制备的层状支架不仅具有良好的机械强度，可承受负重部位的力学需求，还能够促进组织再生细胞（如间充质干细胞[MSCs]和人脐静脉内皮细胞[hUVECs]）的附着、迁移和增殖，成为研究骨类器官的有力工具。更重要的是，在没有添加生长因子的情况下，这些支架也能显著加速新血管形成，并将巨噬细胞从促炎M1型转变为抗炎M2型，从而促进骨再生（图1）。

 

 

图1 用于体外3D细胞培养和体内LSBD修复的SF层状支架的构建；a) 通过冷冻铸造仪器制备具有类骨层状结构的SF支架，该仪器包括液氮箱、加热线圈、铜棒和温度控制系统；b) 在SF层状支架中接种MSCs后，MSCs在层状表面粘附、迁移和增殖；c) 将接种MSCs的支架植入小型猪模型的LSBD模型中；d) 植入后早期，SF层状支架在体内募集炎症细胞并促进血管再生；e) 植入后期，支架的持续降解和成骨-血管生成耦合促进新骨的再生和骨基质成熟

 

1. SF层状支架的特性

研究人员首先对比了由传统冷冻干燥法制备的蜂窝状多孔（HP）支架与采用冷冻铸造法制备的单向层状多孔（LP）结构SF支架。扫描电镜观察显示，所有SF冷冻铸造支架表面和内部均呈现出均匀的层状结构，与天然皮质骨的微观结构高度相似，层厚随SF浓度增加而增加，从6%到22%，层厚从0.9微米增加到3.8微米。这表明，通过调整SF浓度，可以有效控制支架的微观结构及其机械性能。实验结果显示，所有LP支架在相同SF浓度下的弹性模量和压缩应力在片层结构冰晶生长的长轴方向上均高于HP支架。这意味着，通过冷冻铸造技术制造出的具有均匀层状结构的SF支架不仅具备较高的机械强度，而且其力学性能接近宿主骨，适合用于承重部位的骨组织工程，有助于恢复骨组织的正常功能。研究还评估了不同SF支架在生理环境下的降解率。有趣的是，LP支架的降解速度比HP支架更快，这为骨缺损修复提供了更合适的时间窗口。适中的降解速率有助于为新生骨组织提供合适的空间（图2）。

 

 

图2 LP支架的微观结构、机械性能和降解特性；a) LP支架横截面和垂直截面的SEM视图；b) 示意图描绘了从低浓度到高浓度的SF溶液冷冻铸造过程中形成的较薄层状、中等层状和桥接较厚层状的结构；c) LP支架在低倍率下的SEM（左图）和LP支架的超薄切片（右图）；d) LP支架在振荡条件下在PBS或不同酶活性（10 U/mL和1 U/mL）的蛋白酶中的降解曲线；e, f) LP支架的层状厚度（e）和层状间距（f）的量化，显示随着SF浓度的增加，LP支架的层状厚度显著增加，但层状间距几乎不变；g) LP支架的压缩模量；h) σ50指支架在50%压缩应变下的应力

 

2. 对细胞活力及成骨诱导的影响

为了评估SF支架对细胞行为的影响，研究人员将人源MSCs和大鼠源MSCs接种于支架上进行培养。结果均显示，LP支架相较于HP支架更有利于细胞附着、迁移和增殖，在长期细胞活力实验中，LP支架上的MSCs数量多于HP支架，且细胞在LP支架上分布更均匀，形态更佳（图3）。这种良好的细胞亲和性为骨组织的再生提供了充足的细胞来源。

 

在成骨诱导实验中，LP支架上的细胞表现出更高的成骨标志物表达，如BMP2和RUNX2，以及更多的矿化沉积。这表明LP支架能够有效诱导MSCs向成骨细胞分化，进而发育成皮质骨类器官。这一发现进一步表明，具有层状结构的SF支架可能更适合用于骨组织器官的发育与再生。

 

 

图3 MSCs在SF基3D支架中的形态、增殖和成骨分化；a) 天然骨和LP支架的微观到宏观形态示意图，显示皮质骨组织和LP支架在微米级别具有相似的层状结构，有利于细胞粘附和迁移；b) SF基3D支架内hMSCs的长期细胞活性；c) hMSCs在SF支架内培养4、10和14天后的3D共聚焦成像。绿色荧光代表FITC标记的细胞，蓝色荧光表示SF支架的自发荧光；d) SEM图像显示，LP支架层状结构上的hMSCs明显沿层状延伸方向伸长，而HP支架上的hMSCs随机伸长；e, f) 在成骨诱导培养基中培养14天的rMSCs的免疫荧光染色（e，细胞中的BMP2标记为绿色，细胞中的Runx2标记为红色；支架在大面积上也表现出自发的绿色荧光）和茜素红染色（f）；g, h) 通过ELISA在14天时培养基上清液中RUNX2（g）和BMP2（h）浓度的定量分析；i, j) 在正常培养基中培养14天的hMSCs的ALP定量分析（i）和归一化的OCN和Col-1 mRNA水平（j）

 

3. 血管生成与免疫调节作用

研究发现LP支架还能显著促进血管内皮细胞增殖和迁移，促进内皮细胞的行为，这为骨缺损修复提供充足的血液供应和营养物质。此外，支架还能够调节巨噬细胞的表型，使其从促炎型（M1型）转化为抗炎型（M2型），从促炎状态转向抗炎状态。这种特性有助于加速新血管形成并减少炎症反应，进一步支持了其在骨修复中的应用潜力（图4）。

 

 

图4 LP支架对hUVEC细胞行为和巨噬细胞极化的影响；a) hUVECs在LP支架上的增殖评估；b) hUVECs在支架上的形态。c) 在支架上培养的hUVECs中CD31表达的免疫荧光可视化；d, e) 在SF基支架（LP和HP）上培养的巨噬细胞的流式细胞术（d）和M1/M2极化图（e）

 

4. 动物实验：大鼠骨缺损模型中的初步验证

研究人员首先在大鼠骨缺损模型中测试了这种层状支架的效果。通过Micro-CT成像，他们观察到在植入后1个月，支架已经促进了新骨组织的生长，骨缺损区域开始被新生骨组织填充。到了3个月时，骨缺损几乎完全愈合，显示出层状支架在骨修复中的巨大潜力。随后进行马松三色染色（图5c）和半定量分析（图5d、5e），更详细地分析再生骨组织的分布和成熟度。植入1个月时，LP组MT染色呈淡蓝色（来自纤维组织的胶原纤维）和红色（细胞质）（图5c），表明宿主炎症细胞和纤维细胞在这些支架内被募集。值得注意的是，植入1个月后，在LP支架周围观察到一小块矿化骨组织（深蓝色，图5c， 5f）。其中，MSC接枝的 LP12的新生骨再生迹象最多。通过免疫组化染色，研究人员发现层状支架能够显著提高骨基质蛋白（如OPN和OCN）的表达。这些蛋白在骨形成过程中起着关键作用，它们的高表达表明层状支架能够有效促进骨基质的形成和矿化，加速骨组织的成熟。

 

此外，支架生物降解可以为骨组织再生提供合适的位点，支架降解动力学与支架的几何形状高度相关。甲苯胺蓝染色显示，与1个月相比，LP支架和HP12支架在植入3个月后降解明显，而HP18支架降解面积最小（图5h， 5i），说明LP支架适当的降解率可以促进骨组织再生。综上所述，具有板层结构的LP支架可以在植入早期招募细胞渗透进支架，从而实现支架降解和骨重塑。

 

 

图5 使用圆柱形LP支架修复大鼠桡骨缺损；a) 示意图显示在大鼠骨缺损模型中接种hMSCs的LP支架以诱导成骨；b) 支架植入缺损区域后1个月和3个月的 micro-CT 图像。虚线框显示原始缺损区域；c) 植入1个月和3个月后支架与再生组织复合物的典型MT染色；d, e) MT染色的面积百分比（d）和强度密度（e）的半定量结果；f, g) 手术后1个月接种或未接种hMSCs的支架中OPN的免疫组织学特征；h, i) 甲苯胺蓝染色图像（h）和半定量结果（i）

 

5. 猪模型中的进一步验证

为了进一步验证层状支架的效果，研究人员在猪模型中进行了更深入的实验，首先，将圆柱形LP支架植入巴马（BM）猪的LSBD，其片层垂直于长骨的z轴（长度方向，图6）。在植入后2个月，micro-CT 成像显示，层状支架组的骨缺损区域已经出现了明显的骨再生迹象，而对照组的骨缺损几乎没有变化。到了5个月时，层状支架组的骨缺损几乎完全愈合，新骨组织与原有骨组织完美融合，显示出层状支架在大型动物模型中的有效性。为了验证血管生成是否与骨修复效果有关，研究人员发现，2个月后，未接种和MSCs接种的LP18组均出现了小直径血管的再生。令人惊讶的是，术后5个月，有和没有MSC接种的LP18组的再生血管数量和直径都大于没有MSC接种的HP18组。这些结果表明，与HP支架相比，LP支架可以促进骨缺损区血管的形成。上述在BM猪模型的体内实验结果与大鼠骨缺损实验结果一致，即具有有序板层结构的LP支架能够促进细胞的募集和增殖，从而促进早期血管化、OPN的表达和血管化骨组织在LSBD部位的再生。

 

之后，为了验证板层结构植入方向对骨再生效果的影响，研究人员制备了大尺寸长方体LP支架，沿平行于骨z轴的板层方向修复BM猪缺损骨组织（平行型植入，图7），结果令人惊喜。短短三个月内，即使没有生长因子的辅助，支架也成功促进了新血管的生成，加速了骨再生，修复了大型骨缺损。而且，通过控制层状结构与骨长轴平行植入，骨再生效果还能进一步提升。进一步观察发现，这种支架能通过改变巨噬细胞的表型，从促炎的 M1 型转变为抗炎的 M2 型，为骨再生营造良好的免疫环境。同时，支架的降解速率也与骨再生过程完美匹配，在降解过程中为新生骨组织提供了合适的空间和条件。通过这些动物实验，丝素蛋白层状支架在骨缺损修复中展现出了卓越的效果。从大鼠到猪模型，平行于骨长轴的植入方式不仅促进了新骨组织的生长，还加速了骨组织的成熟和功能恢复。

 

 

图6 在猪胫骨缺损中使用垂直于长骨长轴（z轴）的层状LP支架进行骨再生分析；a) 示意图显示猪LSBD模型的建立以及SF支架在缺损部位的定向和放置；b) 术后两个月的定量 micro-CT 评估骨参数，包括骨矿物质密度（BMD）、组织体积比（BV, BV/TV）和小梁骨属性（Tb. Th, Tb. N, Tb. Sp）；c) 植入2个月和5个月后猪胫骨骨再生的代表性micro-CT 图像；d) 支架-组织复合物的典型MT染色

 

 

图7 在猪胫骨缺损中使用平行于长骨z轴的层状LP支架进行血管化和骨再生。a) 示意图显示矩形猪骨缺损模型的构建和矩形SF支架的植入；b) 再生猪骨的代表性 micro-CT 图像；c) 图像显示植入后1个月和3个月的再生骨组织。虚线框表示支架存在的位置；d) 猪骨缺损模型中OCN、CD31、CD80和CD206的MT染色和免疫组织学特征；e) 示意图显示LP支架在缺损骨部位诱导基于血管化的骨再生过程。当LP支架植入时，血凝块在LP支架周围形成，并在手术期间吸引炎症细胞识别支架。在植入中期，LP支架在体内巨噬细胞的影响下有序降解；同时，小血管和骨痂在植入支架部位逐渐形成。在后期，LP支架在体内降解，骨痂组织转变为结构有序的成熟骨组织

 

未来展望：骨修复的新曙光

这项研究的意义重大，它不仅提供了一种无需外源性生长因子、仅通过改变支架微观结构和植入方式就能实现骨组织修复的新方法，还为未来皮质骨类器官的制造和骨修复策略的发展开辟了新道路。此外，该支架技术有望应用于其他骨缺损修复领域，例如脊柱融合、关节置换等，为更多骨缺损患者带来福音！想象一下，未来那些因各种原因遭受骨缺损困扰的患者，或许能借助这种丝素蛋白层状支架，重新恢复骨骼的健康和生理功能，告别长期的病痛折磨。当然，这只是一个开始，后续还需要更多的研究来优化支架的性能，探索其在不同类型的骨缺损修复中的应用潜力。但无疑，这项研究已经为骨组织工程领域注入了一剂强心针，让我们对战胜骨缺损这一医学难题充满了更多信心。

 

参考资料：

https://doi.org/10.1002/adma.202414543

 

来源：课题组供稿

 

 

来源：Internet

关键词： 骨修复支架材料