摘 要： 建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定喘舒片中10种中药活性成分的含量。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分离，以甲醇-0.2%（体积分数）乙酸溶液作为流动相进行梯度洗脱。在电喷雾离子源，多反应监测负离子模式下扫描，以外标法定量。10种中药活性成分在各自质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 3，检出限为0.594～101.711 ng/mL。样品的平均回收率为93.42%～108.62%，测定结果的相对标准偏差为0.5%～6.6%（n=6）。该方法操作简单、灵敏度高、准确性好，可以为喘舒片的质量控制和后续研究提供方法参考和数据支持。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法； 喘舒片； 中药活性成分； 质量控制

 

喘舒片是一种在二十世纪八十年代在“双黄片”基础上改进而成的中西药复方制剂，主要用于治疗慢性气管炎。其组成成分包括升华硫、大黄粉、盐酸双氯醇胺和黄芩提取物，具有显著的镇咳、平喘和消炎作用[1]。升华硫为其主药，具有温肾纳气、提高抵抗力的作用，在北方寒冷地区更易发挥疗效[2]；大黄的主要活性成分包括蒽醌类、蒽酮类、鞣质类[3-5]，具有泻火解毒、抗菌消炎、清热利湿的功效；黄芩提取物[6]中的多种黄酮类成分共同作用，例如汉黄芩苷、汉黄芩素具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎的作用[7]，野黄芩苷具有抗肿瘤作用[8]；盐酸双氯醇胺为选择性较高的β2受体激动剂[9]，具有舒张支气管平滑肌，缓解支气管痉挛的功效。

现行国家标准中，盐酸双氯醇胺的含量测定采用紫外-可见分光光度(UV)法，企业标准中采用高效液相色谱(HPLC)法测定黄芩苷的含量和盐酸双氯醇胺的含量均匀度，同时也采用UV法测定盐酸双氯醇胺的含量。相关文献显示，HPLC法[9-11]可用于测定盐酸双氯醇胺和黄芩苷的含量、HPLC波长切换法[12]可用于同时测定多种成分的含量。笔者课题组首次建立了测定喘舒片主药升华硫中硫含量的HPLC测定法，对喘舒片中的硫含量进行质量控制。然而，喘舒片的药效是多种活性成分协同作用的结果，只控制其中一种中药活性成分无法全面的评价其质量的优劣。王瑞芬等[13]采用HPLC波长切换法测定了盐酸克仑特罗、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，需采用3种波长且检测时间较长(60 min)、色谱柱耐受性较差。

笔者建立超高效液相色谱-串联质谱法[14-15]同时测定喘舒片中大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、番泻苷A、没食子酸、汉黄芩苷、汉黄芩素、野黄芩苷10种中药活性成分。该方法对于含量较低的成分，如没食子酸、番泻苷A，有较高的灵敏度，对被测成分在液相条件下的分离度没有强制要求，具有较好的专属性，可为更好的控制喘舒片的质量提供参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20AD XR型，日本岛津公司。

质谱仪：AB SCIEX QTRAP 4500型，美国爱博才思公司。

电子天平：MS204TS型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器公司。

超声波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超声仪器有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸：均为质谱纯，德国默克公司。

水：蒸馏水，广州屈臣氏饮料有限公司。

大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、番泻苷A、没食子酸、汉黄芩苷、汉黄芩素、野黄芩苷对照品：纯度(质量分数)分别为99.3%、96.0%、99.4%、97.5%、99.2%、95.6%、91.5%、98.5%、100.0%、91.5%，批号分别为110757-201607、110756-201913、110796-201912、110795-202011、110758-201817、110824-202304、110831-201906、112002-201702、111514-202207、110842-202010，中国食品药品检定研究院。

喘舒片样品：2022年度山东省药品质量风险监测任务中收集的具有代表性的样品,均为糖衣片。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；流动相：A相为甲醇， B相为0.2%(体积分数)乙酸溶液，流量为0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：2 μL。洗脱方式：梯度洗脱,洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；电离模式：负离子模式；检测模式：多反应监测（MRM）模式；离子化电压：-4 500 V；离子化温度：550 ℃；喷雾器流量：50 L/min；气帘气流量：35 L/min；喷撞气流量：8 L/min；辅助加热气流量：50 L/min。

1.3 溶液的制备

1.3.1 混合对照品溶液

分别精密称取没食子酸、番泻苷A、野黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素甲醚、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品适量，用甲醇作溶剂，制成质量浓度分别为89.030、21.682、89.304、101.160、21.169、109.000、39.741、43.017、40.435、42.543 μg/mL的单一对照品储备液。再分别精密量取10种单一对照品储备液适量，制成质量浓度分别为0.036、0.035、0.357、4.046、0.339、4.360、0.032、0.034、0.323、0.340 μg/mL的混合对照品溶液。

1.3.2 系列混合标准工作溶液

分别精密量取单一对照品储备液适量，制成含没食子酸、番泻苷A、野黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素甲醚、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品质量浓度均分别为0.071、0.069、0.714、8.093、0.677、8.720、0.064、0.069、0.647、0.681 μg/mL的系列混合标准工作溶液。

1.3.3 样品溶液

取喘舒片样品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.15 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz） 30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至标线，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

1.4 样品测定

取样品溶液与系列混合标准工作溶液注入超高效液相色谱-串联质谱仪中，在1.2仪器工作条件下进样检测，绘制标准工作曲线，以外标法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 样品处理方法的优化

分别以30%甲醇、60%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、乙醇溶液作为提取溶剂制备样品溶液，结果表明，以甲醇作为提取溶剂时，色谱峰面积相对较大，因此选用甲醇作为提取溶剂；考察超声及加热回流两种提取方式得到的图谱，结果发现两种提取方式得到的图谱相差不大，考虑到操作的简便性，选择超声提取法作为样品的提取方法；考察超声15、30、45 min后得到的图谱，发现超声30 min与超声45 min得到的图谱相差不大，故选择超声时间为30 min。

2.2 质谱条件的优化

采用针泵进样方式，以7.5 μL/min的流量向质谱仪中注入200 ng/mL的单一对照品溶液，对每个目标活性成分进行质谱参数优化，包括去簇电压和碰撞能量，根据质谱响应确定定量离子对，各活性成分在负离子模式下，有较高的质谱响应值，因此选择负离子模式进行定量分析。优化后的多反应监测质谱参数见表2。

表2   多反应监测质谱参数

Tab. 2   Multi-reaction monitoring mass spectrum parameters

 

2.3 色谱条件的优化

水相中加入有机酸可以促进目标成分的离子化，其响应值明显增大，灵敏度增大。分别选择甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%乙酸溶液、乙腈-0.05%乙酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.2%乙酸溶液、甲醇-0.3%乙酸溶液作为流动相，考察了不同流动相体系下的色谱图，结果表明，以甲醇-0.2%乙酸溶液为流动相时，各色谱峰峰形和分离度较好，灵敏度较高，基线平稳，故选择以甲醇-0.2%乙酸溶液作为流动相。

考察了ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 2种型号的色谱柱。结果表明，2种色谱柱均具有良好的分离效果，但是各活性成分在ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱上有更好的色谱峰形，响应强度较好，因此选择ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

2.4 线性关系、检出限和定量限

取系列混合标准工作溶液，用甲醇逐级稀释，在1.2仪器工作条件下进行测定，以各目标物对应的峰面积(y)为纵坐标，对应的质量浓度(x)为横坐标，绘制标准工作曲线，并计算线性方程与相关系数。分别以3倍信噪比所对应的质量浓度确定目标物的检出限，以10倍信噪比所对应的质量浓度确定目标物的定量限。10种中药活性成分的的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。由表3可知，各成分的质量浓度在各自范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 3，检出限为0.594～101.711 ng/mL，定量限为1.979～339.036 ng/mL。

表 3   10种中药活性成分的的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 3   Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of 10 Chinese medicine active ingredients

 

2.5 稳定性试验

取1.3.3处理的喘舒片样品溶液1份，分别在样品溶液制备后第0、2、5、7、10、12、24 h在1.2仪器工作条件下进样测定，稳定性试验结果见表4.由表4可知，测定结果的相对标准偏差（RSD）为0.5%～2.1%，该方法稳定性良好。

表4   稳定性试验结果

Tab. 4   Results of stability test

 

2.6 加标回收与精密度试验

取已知含量的喘舒片样品约0.075 g，精密称定，分别加入相当于含没食子酸9.793 μg、番泻苷A5.637 μg、野黄芩苷58.941 μg、汉黄芩苷423.550 μg、大黄素甲醚5.292 μg、汉黄芩素152.600 μg、芦荟大黄素5.961 μg、大黄酸3.872 μg、大黄素10.109 μg、大黄酚55.962 μg的混合对照品溶液，平行制备6份样品溶液，在1.2仪器工作条件下进行测定，计算加标回收率，加标回收及精密度试验结果见表5。由表5可知，样品的平均回收率为93.42%～108.62%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.5%～6.6%(n=6)，表明该方法有较好的精密度和准确度。

表5   加标回收与精密度试验结果

Tab. 5   Results of standard recovery and precision test

 

3.结语

 

建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定喘舒片中10种中药活性成分的含量。该方法操作简单，检出限低，灵敏度高，能够准确测定出喘舒片中的微量成分的含量，可为喘舒片的质量控制、后续研究、有效监管提供方法参考和数据支持。

 

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引用本文： 李敏，于姗姗，齐红，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定喘舒片中10种中药活性成分［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：58. (LI Min, YU Shanshan, QI Hong, et al. Simultaneous determination of 10 kinds of active ingredients in Chuanshu Tablets by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 58.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 喘舒片 中药活性成分