摘 要： 建立正交试验结合化学计量学对“柴胡-桂枝-生姜”中药组合提取工艺的优化方法。采用高效液相色谱法同时测定“柴胡-桂枝-生姜”中药组合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量，并通过L9（34）正交试验结合主成分分析法优化该中药组合的乙醇提取工艺。3种成分在考察浓度内与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.001 4～0.904 1 mg/mL。平均回收率为97.72%～101.62%，测定结果的相对标准偏差为0.41%～1.01%（n=6）。最终确定优化提取工艺参数为6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。所得提取工艺有较好的可行性与可控性，可适用于工业化生产，为含挥发性成分的经典名方开发提供实验参考。

关键词： 高效液相色谱法； 挥发性成分； 正交试验； 主成分分析； 乙醇提取工艺

中药中的挥发性成分是由萜类、苯丙素类、脂肪酸类等成分组成的油状物，是中药辛味的重要药性物质基础[1-2]。辛味中药（含挥发性成分中药）具有散、行、润、燥等功效，在表证和气血阻滞等中医病证治疗方面应用广泛[3]。在国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》中有83%的经典名方含具有挥发性成分的中药[3]。传统汤剂主要以水煎煮为主，通过控制煎煮顺序、芳香气味强弱等方式保证辛味中药的挥发油提取率。而传统煎煮往往容易造成挥发油损失[4]，难以保证辛味中药的疗效及质量稳定性[5-6]。现代工艺研究表明，采用乙醇提取可有效提高挥发性成分的提取率[7]，对中药制剂的质量控制和疗效保障具有重要意义。“柴胡-桂枝-生姜”是柴胡桂枝汤、柴胡加龙骨牡蛎汤和柴苓汤等经典名方中常见的辛味药组合，其比例多为12∶4.5∶4.5。柴胡和解表里、疏肝升阳，桂枝发汗解肌、温通经脉、助阳化气，生姜解表散寒、温中止呕、温肺止咳，三药合用共奏解表清热，调和表里之效[8‒10]。该中药组合中的挥发性成分为重要的活性成分，在制剂中发挥着重要作用。前期药理研究表明，其挥发性成分通过调节炎症因子水平减轻H1N1诱导的小鼠肺炎[11]。此外，中药组合中的其他主要成分例如柴胡皂苷A、桂皮醛等在抗炎、抗病毒等方面均有良好的效果[12-13]。笔者建立了高效液相色谱法同时测定中药组合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的方法，并通过L9（34）正交试验结合主成分分析法优化中药组合乙醇提取主要药效成分的提取工艺参数[14]，以期为柴胡桂枝汤、柴胡加龙骨牡蛎汤等含挥发性成分中药的经典名方研究开发提供参考。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260型，美国安捷伦科技有限公司。电子天平：CPA225D型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。电热鼓风干燥箱：FXB101-2型，上海樹立仪器仪表有限公司。低温循环（真空）泵：DLSB-ZC型，郑州长城科工贸有限公司。LCD数显加热型圆盘磁力搅拌器：MS-H-ProT型，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素对照品：纯度（质量分数）均为98%，批号分别为B20146、B21081、B21838，上海源叶生物科技有限公司。乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。中药样品：柴胡饮片产地为山东，批号为230301；桂枝饮片产地为广东，批号为230102，均购自山东百味堂中药饮片有限公司。生姜：市售。实验所用其他试剂均为分析纯。实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温：30 °C；检测波长：柴胡皂苷A为210 nm，桂皮醛为290 nm，6-姜辣素为225 nm；进样体积：25 μL；流动相：A相为乙腈，B相为水，流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序为0～18 min 32% 乙腈，18～27 min 32%～38% 乙腈，27～41 min，38% 乙腈。

1.3 样品溶液制备

对照品溶液：分别取柴胡皂苷A对照品、桂皮醛对照品、6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得质量浓度分别为1.146、4.601、0.414 mg/mL的对照品贮备溶液。样品溶液：按照柴胡12 g、桂枝4.5 g、生姜4.5 g称取药材，加入6倍量70%乙醇加热回流提取1 h，过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。阴性对照溶液：“柴胡-桂枝-生姜”组合分别减去柴胡、桂枝、生姜单味药材，采用样品相同的制备方法，制备阴性对照溶液。空白溶液：取70%乙醇过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。

1.4 实验方法

取样品溶液及对照品溶液，按照1.2仪器工作条件测定，以色谱峰面积外标法对柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素进行定量，然后通过L9（34）正交试验结合主成分分析，综合评价最佳提取工艺。

 

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

参考《中华人民共和国药典》（2020版）一部“柴胡”“桂枝”以及“生姜”的含量测定方法进行优化[15]，分别选用乙腈-水溶液、乙腈-0.1% 甲酸水溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液为流动相对柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素进行考察。结果表明，采用乙腈-水溶液流动相体系，对3种成分的色谱分离度良好且稳定性强。将照品溶液在190～400 nm波长下进行全波长扫描，结果表明，3种成分分别在210、290、225 nm下有较强吸收且分离度较好。将柱温分别设置为25、30、35 ℃进行试验。结果表明，相比在25、35 °C，当温度为30 ℃时，色谱峰基线平稳且柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的色谱峰分离度良好。

2.2 线性方程与检出限

取质量浓度分别为1.146、4.601、0.414 mg/mL的柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素对照品溶液，逐级稀释，得到系列标准工作溶液，按照1.2仪器工作条件进行分析，以目标物的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。以3倍信噪比时对应的溶液中柴胡皂苷 A、桂皮醛、6-姜辣素的质量浓度作为方法检出限和定量限。3 种目标物的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表1。由表1可知，3种成分在考察浓度内与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.999，方法检出限为0.001 4~0.904 1 mg/mL，表明该方法具有良好的灵敏度，适于定量。

 

表1   线性范围、线性方程、相关系数及检出限Tab. 1   Linear range, linear equation, correlation coefficient, and detection limit

 

2.3 方法专属性

分别精密吸取混合对照品溶液、样品溶液、缺柴胡阴性溶液、缺桂枝阴性溶液、缺生姜阴性溶液及空白样品溶液，在1.2仪器工作条件下进样分析，色谱图如图1所示。从图1中可以看出，空白样品溶液及阴性溶液中的成分对样品溶液中3种成分的测定无干扰，表明该方法专属性良好。

 

图1   色谱图Fig. 1   chromatograms

1—桂皮醛；2—柴胡皂苷A； 3—6-姜辣素

2.4 稳定性试验

按照1.3方法制备样品溶液，然后在第0、2、4、6、12、24 h时，按1.2仪器工作条件进样分析，记录对应色谱峰面积，计算峰面积的相对标准偏差，试验结果见表2。由表2可知，样品溶液在24 h内有较好的稳定性。

表2   稳定性试验结果Tab. 2   Stability test results

 

2.5 精密度试验

按1.3方法平行制备6份样品溶液，在1.2仪器工作条件下进样分析，记录对应色谱峰面积，并计算峰面积的相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，测定结果的相对标准偏差为0.41%~1.01%，表明该方法精密度良好。

 

表3   精密度试验结果Tab. 3   Precision test results

 

2.6 样品加标回收试验

精密量取样品溶液0.5 mL于2 mL容量瓶中，精密加入0.5 mL混合对照品溶液（其中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的质量浓度分别为0.433 3、0.473 0、0.047 2 mg/mL），用甲醇定容，摇匀，滤过，在1.2仪器工作条件下测定，试验结果见表4。

 

表4   样品加标回收试验结果Tab. 4   Sample spiked recovery test results

 

由表4可知，实际样品加标的平均回收率为97.72%～101.62%，表明该方法具有较高的准确度，符合分析要求。

2.7 提取工艺优化

2.7.1 正交试验结果及分析以3种成分的综合评分为评价指标，提取溶剂（70%乙醇）量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为3种考察因素，设计正交试验对提取工艺进行优化。采用综合加权评分法进行分析，按照下式计算综合评分：综合评分 = （柴胡皂苷A含量/最高柴胡皂苷A含量）× 0.35 +（桂皮醛含量/最高桂皮醛含量）× 0.35+ （6-姜辣素含量/最高6-姜辣素含量）× 0.3，正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。由表6可知，3种因素影响程度依次为C（提取次数）＞A（提取溶剂量）＞B（提取时间），各因素对提取效率均有显著影响（P < 0.05），表明加入6倍量70%乙醇，提取3次，每次提取1.5 h的提取效率高。

 

表5   L9（34）正交试验结果Tab. 5   L9 (34) Orthogonal test results

 

表6   方差分析结果Tab. 6   Results of analysis of variance

 

2.7.2 液相图谱信息主成分分析中药成分复杂多样，为了进一步全面整体性评价“柴胡-桂枝-生姜”中药组合的提取工艺，采用指纹图谱结合主成分分析进行深入研究。“柴胡-桂枝-生姜”中药组合高效液相色谱 3D光谱图如图2所示，“柴胡-桂枝-生姜”中药组合于210 nm检测波长的色谱图如图3所示。

 

图2   “柴胡-桂枝-生姜”中药组合HPLC 3D光谱图

Fig. 2   HPLC 3D spectrum of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination

 

图3   “柴胡-桂枝-生姜”组合于210 nm检测波长的色谱图

Fig. 3   Chromatogram of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination at a detection wavelength of 210 nm

 

1~18—共有特征色谱峰

从图2、图3中可以看出，在全波长扫描下，于210 nm波长处的色谱峰信息丰富，对其中的18个共有特征色谱峰进行积分处理，以色谱峰面积为指标进行主成分分析，结果显示前5个主成分的累计贡献率为91.076%，可用于“柴胡-桂枝-生姜”中药组合的整体评价。各主成分的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率及各主成分高载荷色谱峰[16]结果数据见表7。

 

表7   主成分的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率及高载荷色谱峰

Tab. 7   Eigenvalues, variance contribution rates, and cumulative variance contribution rates of principal

 

将原始指标进行标准化处理，计算得5种主成分的得分，再根据各主成分的贡献率，推导出主成分综合评价线表达式为F=0.373 02Y1+0.221 63Y2+0.147 60Y3+0.099 15Y4+0.069 36Y5。根据表达式得出综合得分，用于整体性评价提取工艺，结果见表8。由表8可知，5号工艺即6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h，与正交试验结果相同，说明从整体评价提取工艺与测定指标性成分柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量评价提取工艺可相互对应，使提取工艺更准确、可靠[17-18]，因此5号工艺为最佳工艺。

 

表8   主成分得分和综合得分Tab. 8   Principal component scores and comprehensive scores

 

2.8 提取工艺验证

依据筛选出的中药组合最佳提取工艺参数，进行3批验证性试验。结果表明，柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的相对标准偏差分别为0.23%、0.63%、0.60%，表明优化方法准确、合理、可靠。使用该提取工艺制备的3批样品中的各指标性成分含量稳定，且提取率较高，表明此工艺条件重复性好，稳定可行。

 

3 结论

建立了高效液相法同时测定“柴胡-桂枝-生姜”中药组合中柴胡皂苷A、桂皮醛及6-姜辣素含量的方法，并对色谱条件进行了优化，适用于3种成分含量的同时测定。采用乙醇提取解决了挥发性成分在提取时油水分离困难、提取率较低等问题，并在此基础上，通过指标性成分定量与色谱图特征信息分析结合的方法对该中药组合的乙醇提取工艺进行优化。采用正交试验，以多个成分的含量为指标综合评价提取工艺，使所得结果具有准确性和可靠性。同时结合主成分分析，选择多个代表性综合指标（主成分）代替原始变量，最大限度地保留样本的原始信息并对样本做出整体性评价，与中药多成分、多靶点的特点相契合。最终优化提取工艺为6倍量70%乙醇提取三次，每次1.5 h。所建立的分析评价方法具有快速简便、稳定性好、结果精确度高的特点，可为含有挥发性成分的经典方剂的进一步开发提供实验基础。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 正交试验 “柴胡-桂枝-生姜”中药