一、流动相组成的关键作用

 

（一）有机溶剂的选择

 

在多肽纯化中，常用的有机溶剂如乙腈、甲醇等，它们在流动相中的比例对多肽的分离起着关键作用。乙腈具有较低的黏度和较高的洗脱强度，能够有效地调节多肽在固定相和流动相之间的分配系数。当乙腈比例增加时，流动相的洗脱能力增强，多肽在色谱柱上的保留时间缩短。例如，对于疏水性较强的多肽，适当提高乙腈比例，可以使其更快地从固定相上洗脱下来，实现与其他杂质的分离。而甲醇虽然洗脱强度相对较弱，但它的极性与乙腈有所不同，在某些情况下，使用甲醇 - 水体系作为流动相，能够对特定结构的多肽产生更好的分离效果，这是因为不同的有机溶剂与多肽分子之间的相互作用方式存在差异，从而影响了多肽在色谱柱中的迁移行为。

 

（二）水相的影响

 

水相作为流动相的另一重要组成部分，不仅提供了一个极性环境，还参与了与多肽分子的相互作用。水的 pH 值可以通过添加酸或碱进行调节，进而影响多肽的电荷状态。此外，水中的离子强度也会对多肽的分离产生影响。例如，在离子交换色谱中，通过调节水相中的盐浓度，可以改变离子交换树脂与多肽之间的静电相互作用，从而实现多肽的洗脱和分离。低浓度的盐溶液有利于多肽与离子交换树脂的结合，而高浓度的盐溶液则会促使多肽从树脂上洗脱下来。

 

二、pH 值对多肽分离的影响

 

（一）多肽的电荷状态与 pH 的关系

 

多肽是由氨基酸组成，氨基酸残基上的酸性和碱性基团在不同 pH 条件下会发生质子化或去质子化反应，从而改变多肽的电荷状态。如羧基（-COOH）在酸性条件下以质子化形式存在，而在碱性条件下则去质子化形成羧基负离子（-COO⁻）；氨基（-NH₂）在酸性条件下质子化形成铵离子（-NH₃⁺），在碱性条件下为游离氨基（-NH₂）。这种电荷状态的变化直接影响了多肽与固定相之间的相互作用。在反相色谱中，当多肽带电荷较多时，其与非极性固定相之间的疏水作用减弱，保留时间缩短；反之，多肽呈电中性或电荷较少时，疏水作用增强，保留时间延长。在离子交换色谱中，pH 值决定了多肽与离子交换树脂之间的静电相互作用，从而控制多肽的结合与洗脱。

 

（二）考虑多肽的稳定性

 

在选择流动相 pH 时，必须充分考虑多肽的稳定性。极端的 pH 条件可能导致多肽的降解、变性或聚集。例如，在酸性过强的条件下，某些氨基酸残基（如天冬酰胺、谷氨酰胺）可能会发生脱酰胺反应；在碱性条件下，多肽的肽键可能会水解。因此，需要在保证有效分离的前提下，选择对多肽稳定性影响较小的 pH 范围。

 

三、流动相添加剂的作用

 

（一）缓冲盐的使用

 

缓冲盐在流动相中起着维持 pH 稳定的重要作用。常用的缓冲盐如磷酸盐、醋酸盐等，它们能够抵抗外界因素对 pH 值的影响，确保在整个分离过程中流动相的 pH 保持相对恒定。这对于保证多肽分离的重复性和稳定性至关重要。此外，缓冲盐的种类和浓度还会影响多肽与固定相之间的相互作用。例如，在反相色谱中，某些缓冲盐可以与多肽分子形成离子对，从而改变多肽的保留行为，提高分离效果。

 

（二）离子对试剂的应用

 

离子对试剂常用于反相色谱中，以改善对强极性多肽的分离效果。离子对试剂能够与多肽分子上的离子基团形成离子对，使其在非极性固定相上的保留增加。例如，对于带正电荷的多肽，使用烷基磺酸盐等阴离子型离子对试剂，可以与多肽形成离子对，增强其与 C18 固定相之间的疏水作用，从而实现更好的分离。然而，离子对试剂的使用也需要谨慎，因为它们可能会对色谱柱造成一定的损伤，并且在后续的样品处理中需要去除。

 

（三）其他添加剂

 

除了缓冲盐和离子对试剂外，还有一些其他添加剂可用于改善多肽的分离效果。例如，在流动相中加入少量的三氟乙酸（TFA），它可以作为一种质子供体，调节流动相的 pH 值，同时还能与多肽分子形成弱相互作用，改善峰形。此外，一些表面活性剂也可以添加到流动相中，用于改变多肽分子的表面性质，增强其在固定相和流动相之间的分配差异，从而提高分离度。

 

综上所述，在多肽纯化过程中，流动相的筛选是一个复杂而关键的环节。需要综合考虑流动相的组成、pH 值、添加剂等因素对多肽分离的影响，通过合理的选择和优化，才能实现高效、高纯度的多肽分离。

 

来源：药事纵横

关键词： 流动相 多肽纯化