摘 要： 建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定干血斑中维生素A和维生素E的含量。样品经纯化水超声提取，甲醇沉淀蛋白，乙酸乙酯萃取，上层萃取液氮气吹干后复溶。采用Accucore C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）分离，在正离子多反应监测模式下进行检测。维生素A、维生素E的质量浓度分别在0.1～3、0.5～30 mg/L范围内和相应色谱峰面积与同位素内标色谱峰面积之比的线性关系良好，相关系数均大于0.995。维生素A、维生素E的样品加标回收率分别为87.2%～92.8%、98.6%～108.5%，测定结果的相对标准偏差均小于8%（n=6）。该方法适用于干血斑中维生素A和维生素E的同时测定。

关键词： 干血斑； 维生素A； 维生素E； 超高效液相色谱-串联质谱法

 

维生素是人体必需的微量营养素，参与调节体内各种代谢过程和生理活动，缺乏或过量都会引发相应的疾病[1‒3]。其中，维生素A具有维持正常视力、促进生长发育、增加机体对传染病的抵抗力等作用，缺乏时可引起夜盲症、角膜干燥症、皮肤干燥脱屑等疾病[4-5]；维生素E具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、增强免疫力、改善血液循环、防止动脉硬化等作用[6]，长期缺乏可引起巨细胞性溶血性贫血、生殖机能障碍等疾病[7]。流行病学研究表明，维生素A、E缺乏或不足仍是一个重要的公共健康问题，尤其在儿童、孕妇、老年等特殊人群中[8]。通过精准检测维生素浓度水平，并对危险因素进行干预，能显著改善维生素缺乏或过量导致的危害，提升国民健康水平[9]。

目前维生素的检测方法主要包括分光光度法、免疫层析法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等[10-11]。液相色谱-串联质谱法因具有灵敏度高、特异性好、多指标同时检测等优势，已成为维生素检测的“金标准”[12-13]。干血斑采样是利用滤纸采集血液样本的技术[14]，相较于常规静脉采血方法，干血斑具有采血量少、储运简便、生物安全性好等优势，是一种适于儿童、孕妇、老年等特殊人群的微创采血方法[15-16]。为了更好地满足临床维生素检测需求，笔者采用超高效液相色谱-串联质谱技术，建立同时测定干血斑中维生素A和维生素E的方法，并进行方法的验证及应用研究。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：SCIEX QTRAP 5500型，美国SCIEX公司。

电子天平：ES225SM-DR型，感量为0.01 mg，上海天美天平仪器有限公司。

多管涡旋混合仪：MTV-100型，杭州奥盛仪器有限公司。

高速冷冻离心机：5427R型，艾本德（上海）国际贸易有限公司。

超声波清洗机：SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

超纯水机：UPH-IV-10TNP型，四川优普超纯科技有限公司。

氮吹仪：BCN9602型，深圳逗点生物技术有限公司。

维生素A（视黄醇，VA）、维生素E（α-生育酚，VE）、[19,19,19,20,20,20-D6]视黄醇（视黄醇-d6）：质量分数分别为96.0%、98.3%、97.0%，批号分别为G0063895、G0089685、G0063135，曼哈格（上海）生物科技有限公司。

3,4-二氢-2,8-二甲基-5,7-二(三氘甲基)-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-6-色满醇（α-生育酚-d6）：质量分数为98%，批号为MBBD0883，美国西格玛奥德里奇公司。

人工全血基质：批号为23I002，北京汇智和源生物技术有限公司。

甲醇：质谱纯，天津市康科德科技有限公司。

乙酸乙酯：质谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

甲酸：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm，美国赛默飞世尔科技公司）；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；流动相：A相为0.1%(体积分数)的甲酸-水溶液，B相为0.1%(体积分数)的甲酸-甲醇溶液，流量为0.4 mL/min；洗脱方式：线性梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.2.2 质谱条件仪

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子模式；数据采集模式：多反应监测扫描(MRM)；离子源温度：500 ℃；离子化电压：5 500 V；气帘气压力：138 kPa；喷雾气压力：414 kPa；辅助加热气压力：345 kPa；碰撞气压力：41 kPa。维生素A、维生素E及内标的质谱参数见表2。

表2   维生素A、维生素E及内标的质谱参数

Tab. 2   Mass spectral parameters of vitamin A, vitamin E and internal standard

 

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

标准储备溶液：精密称取维生素A、视黄醇-d6、维生素E、α-生育酚-d6适量，分别置于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，摇匀，得维生素A、视黄醇-d6标准储备溶液的质量浓度为1 000 mg/L，维生素E、α-生育酚-d6标准储备溶液的质量浓度为2 000 mg/L。

混合内标工作溶液：分别准确移取视黄醇-d6、α-生育酚-d6标准储备溶液适量，用甲醇稀释后混匀，配制成混合内标工作溶液（视黄醇-d6、α-生育酚-d6的质量浓度分别为10、20 mg/L）。

混合标准储备溶液：分别准确移取维生素A、维生素E标准储备溶液适量，用甲醇稀释后混匀，配制成高浓度混合标准储备溶液（维生素A、维生素E的质量浓度分别为60、600 mg/L）和低浓度混合标准储备溶液（维生素A、维生素E的质量浓度分别为2、10 mg/L）。

系列混合标准工作溶液：分别准确移取高、低浓度混合标准储备溶液适量，与人工全血基质混匀，配制成维生素A质量浓度分别为0.100 0、0.245 0、0.390 0、0.680 0、1.260、1.550、3.000 mg/L，维生素E质量浓度分别为0.500 0、1.975、3.450、6.400、12.30、15.25、30.00 mg/L的标准曲线样品系列混合标准工作溶液。按相同方法，制得到维生素A质量浓度分别为0.240 0、0.600 0、1.200 mg/L，维生素E质量浓度分别为4.000、10.00、20.00 mg/L的质控样品系列工作溶液。

1.3.2 标准曲线样品、质控样品和空白样品制备

准确移取系列混合标准工作溶液75 μL，分别滴到滤纸片，晾干，得到干血斑标准曲线样品及质控样品。另取人工全血基质，按照相同方法制成干血斑空白样品。

1.3.3 样品处理

使用直径为3 mm的打孔器，在干血斑样品上取两个干血点（相当于6 μL全血），置于2 mL离心管中，加入75 μL 纯化水，超声提取5 min，加入100 μL混合内标工作溶液，涡旋振荡1 min，加入乙酸乙酯1 000 μL，涡旋振荡10 min，以12 500 r/min的转速离心15 min。吸取乙酸乙酯层900 μL，置于U型96孔板中，氮气吹干，加入体积分数为70%的甲醇-水溶液100 μL复溶，涡旋振荡5 min，以4 000 r/min的转速离心5 min，取上清液测定。

1.3.4 样品测定

取上述样品溶液，在1.2仪器工作条件下测定，以色谱峰面积内标法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 质谱参数优化

由于维生素A和维生素E结构中均存在芳香环、脂肪链和羟基结构，在正离子模式下电离较为稳定，因此采用正离子模式下进行检测。从一级质谱扫描图和二级碎裂质谱扫描图可知，维生素A在ESI正离子模式下形成的[M+H]+准分子离子为m/z 269.3，主要碎片离子为m/z 231.9、m/z 93.0；维生素E的[M+H]+准分子离子为m/z 431.3，主要碎片离子为m/z 342.9、m/z 165.1。采用仪器优化程序对上述离子对的锥孔电压和碰撞能量值进行优化，分别以信号更强的m/z 93.0和m/z 165.1作为定量离子，按相同碎裂模式选择同位素内标的离子对，优化后的参数见表2。

2.2 色谱条件优化

基于维生素A和维生素E的疏水性，选择C18反相色谱柱进行色谱分离。比较了Thermo Scientific Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）和Phenomenex Kinetex C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）对维生素A和维生素E的分离效果，结果显示，Kinetex C18柱分离的维生素A色谱峰出现裂峰，峰形较差，而Accucore C18柱可以实现所有组分的分离且峰形良好，保留时间稳定，因此选择Accucore C18柱作为色谱柱。

分别采用甲醇-水、乙腈-水作为流动相，比较添加甲酸（体积分数为0.1%）对目标化合物色谱峰形及分离效果的影响，结果表明，以甲醇-水作为流动相，并在两相中分别添加体积分数为0.1%的甲酸，可增加分析物的响应强度，各组分分离效果良好，且峰形良好。

2.3 样品处理条件优化

2.3.1 萃取溶剂的选择

维生素A和维生素E均为脂溶性维生素，易溶于正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯等多种有机溶剂。本实验分别考察了乙酸乙酯、正己烷、乙酸乙酯-正己烷（体积比为1∶1）的萃取效果见图1。由图1可知，当乙酸乙酯作为萃取剂时，维生素A和维生素E的响应更强，提取效率更高，且化合物峰形较好，因此，选用乙酸乙酯作为萃取溶剂。

图1   不同提取溶剂对维生素A及维生素E提取效果的影响

Fig. 1   Influence of different solvents on the extraction of vitamin A and vitamin E.

2.3.2 复溶液的选择

分别采用体积分数为50%和70%的甲醇-水溶液作为复溶液，比较目标化合物的峰面积见图2。由图2可知，以体积分数为70%的甲醇-水溶液进行复溶时，目标化合物的响应更强，且色谱峰形较好，因此选择体积分数为70%的甲醇-水溶液作为复溶液。

图2   不同复溶液对维生素A及维生素E复溶效果的影响

Fig. 2   Influence of different solution on the reconstitution of vitamin A and vitamin E.

2.4 选择性

按照1.3.3所述方法处理干血斑空白样品、高浓度质控样品、临床干血斑送检样品，在1.2仪器工作条件下进行测定，在目标成分维生素A、维生素E及内标的保留时间处无杂质干扰，目标成分及内标之间亦无干扰。

 

2.5 残留

按照1.3.3所述方法，分别对干血斑空白样品、标准曲线最低（定量下限）和最高浓度样品进行处理，在标准工作曲线最高浓度样品之后测定空白样品，用目标物的峰面积来评估残留，携带污染测试结果见表3。由表3可知，标准曲线最高浓度样品之后测定的空白样品中，目标物的残留量不超过定量下限的20%，且内标残留量不超过5%，满足分析方法要求[17]。

表3   携带污染测试结果

Tab. 3   Results of carry-over effect

 

2.6 线性关系与检出限、定量限

在1.2仪器工作条件下，对标准曲线样品系列混合标准工作溶液进行测定，以目标物的质量浓度为横坐标（x），以对应的色谱峰面积与同位素内标色谱峰面积之比为纵坐标（y），进行线性回归，绘制标准工作曲线。

以3倍信噪比对应的维生素A、维生素E质量浓度作为方法检出限，以10倍信噪比对应的维生素A、维生素E质量浓度作为方法定量限。

维生素A、维生素E的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表4。

表4   维生素A、维生素E的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 4   Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit, and quantification limit of vitamin A and vitamin E

 

由表4可知，维生素A、维生素E分别在质量浓度分别为0.1～3、0.5～30 mg/L范围内与相应色谱峰面积比线性关系良好，相关系数均大于0.995，满足分析方法要求［17］。

2.7 精密度和准确度

按照1.3.3所述方法，分别对标准曲线最低浓度样品和低、中、高浓度质控样品进行处理，每组6份，在1.2仪器工作条件下进行测定，计算方法精密度和准确度，其中精密度表示为测定值的变异系数，而准确度表示为测定值与标示值的百分比，试验结果见表5。由表5可知，维生素A的准确度为95.0%～106.6%，维生素E的准确度为97.6%～108.6%，二者的精密度均不超过7.2%，满足分析方法要求[17]。

表5   精密度和准确度试验结果

Tab. 5   Results of precision and accuracy assessment

 

2.8 样品加标回收试验

选取3组临床全血样品，每组6份，分别加入低、中、高浓度的混合标准工作溶液，混匀后得加标样品工作溶液，按1.3.2方法制备干血斑加标样品，按1.3.3方法进行处理，然后在1.2仪器工作条件下测定；另取上述临床全血样品制成干血斑样品，用于检测本底值，试验结果见表6。由表6可知，维生素A的加标回收率为87.2%～92.8%，维生素E的加标回收率为98.6%～108.5%，测定结果的相对标准偏差均不超过5.2%（n=6），满足分析方法要求[17]。

表6   样品加标回收试验结果

Tab. 6   Recovery results of spiked samples

 

3. 结语

 

建立了液相色谱-串联质谱法同时测定干血斑样本中维生素A和维生素E含量，分别对质谱、色谱检测条件以及前处理过程中的萃取液、复溶液等进行了优化，从而提高了检测灵敏度。该方法能够在5 min内完成维生素A、维生素E的定性、定量分析，测定样本需求量少、操作简单、检测结果准确、快速，可实现大量临床样本的同时检测，尤其对采血较为困难的婴幼儿，可以实现少量血液样本检测多个项目，为临床维生素的精准检测提供了技术支持。

 

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引用本文： 权帆，詹珍旋，赵宁，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定干血斑中维生素A和维生素E［J］. 化学分析计量，2024，33（12）：17. (QUAN Fan, ZHAN Zhenxuan, ZHAO Ning, et al. Simultaneous determination of vitamin A and vitamin E in dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 17.)

来源：化学分析计量

关键词： 干血斑 维生素A 维生素E