在多肽纯化的复杂征程中，氨基酸的特性宛如一盏明灯，精准指引着流动相选择的方向。多肽由众多氨基酸按照特定肽序串联而成，而每种氨基酸独特的化学结构与性质，如酸碱性、疏水性等，如同密语一般，决定了多肽与流动相、固定相之间的相互作用模式，进而对多肽的分离与纯化成效产生着极为关键的影响。接下来，我们将基于不同类型氨基酸，深入阐述在流动相选择方面的理论依据。

 

一、酸性氨基酸

天冬氨酸（Asp）与谷氨酸（Glu）堪称典型的酸性氨基酸，它们的侧链犹如独特的化学标识，带有额外的羧基。这一结构特征致使它们的等电点较低，天冬氨酸的等电点约为 2.77，谷氨酸约为 3.22。当处理富含这类氨基酸的多肽时，流动相的选择便大有讲究。

反相色谱中的精妙运用

在反相色谱体系下，低pH 值（如 pH 2 - 4）的流动相成为首选。在这样的酸性环境里，多肽中的羧基如同被 “锁定” 在未电离状态，维持质子化形式。此时，多肽整体呈现出微弱的正电趋势，恰似带有微弱正电荷的微小颗粒。而反相色谱中疏水性的 C18 等固定相，仿佛是疏水性的 “捕捉器”，与这些带有微弱正电的多肽能够产生恰到好处的疏水相互作用。这种相互作用如同舞者间的默契配合，使得多肽能够在色谱柱中实现高效分离。反之，若 pH 值偏高，羧基的电离程度显著增强，多肽带上负电，就如同改变了自身的 “电荷属性”，与固定相的疏水作用随之减弱，如同失去了相互吸引的 “魔力”，难以与杂质有效区分，纯化效果自然大打折扣。例如，在合成某种含有多个天冬氨酸残基的生物活性多肽时，采用 pH 3 的磷酸缓冲液与乙腈组成的反相流动相，成功将目标多肽与酸性杂质分离开来，纯度达到 98% 以上。

 

二、碱性氨基酸

精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）共同构成了碱性氨基酸家族。精氨酸的等电点约为 10.76，赖氨酸约为 9.74，组氨酸约为 7.59。这些氨基酸赋予富含它们的多肽独特的化学性质，在流动相选择上也有着特殊要求。

反相色谱的 pH 值奥秘

在反相色谱中，高pH 值（如 pH 8 - 10）的流动相发挥着关键作用。在这种碱性条件下，碱性氨基酸的氨基不易电离，多肽带负电趋势增强。此时，多肽就像带上更多负电荷的 “小离子”，与反相色谱固定相之间的相互作用发生了积极变化。这种带负电的多肽与固定相的结合作用加强，有利于实现分离纯化。然而，倘若 pH 值过低，氨基电离程度加剧，多肽带正电，情况便急转直下。多肽与固定相中键合相的疏水作用大幅减弱，而与硅羟基的次级保留作用开始凸显。这就好比原本和谐的演奏被不和谐音符打乱，多肽在色谱柱中的行为变得不稳定，极易导致峰展宽或拖尾等不良现象，严重影响分离效果。以制备一种富含精氨酸的抗菌多肽为例，当流动相 pH 值控制在 9 时，目标多肽能够在 C18 柱上实现良好分离，峰形对称尖锐；而当 pH 值降为 6 时，峰形严重拖尾，杂质与目标多肽难以有效分离。

 

三、疏水性氨基酸

丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）等共同组成了疏水性氨基酸阵营。当多肽中富含这些疏水性氨基酸时，流动相的组成便成为决定分离成败的核心因素。

反相色谱中有机溶剂的关键作用

在反相色谱体系里，乙腈、甲醇等有机溶剂在流动相中的占比宛如天平上的砝码，对分离效果影响巨大。疏水性多肽与固定相之间的疏水作用十分强烈，恰似两块强力磁铁紧紧相吸。此时，适当提高乙腈等有机溶剂的比例，就如同给流动相注入了更强的“洗脱动力”。有机溶剂比例的增加，提升了流动相的洗脱能力，能够促使多肽更快地从固定相上洗脱下来，实现与其他杂质的高效分离。此外，调节流动相 pH 值这一手段也不容忽视。通过巧妙改变 pH 值，可以改变多肽的电荷状态，如同为多肽重新调整了 “电荷密码”，进一步优化分离效果，使多肽与杂质在色谱柱中的分离更加精准高效。比如，在纯化一种含有大量亮氨酸和异亮氨酸的多肽时，初始流动相乙腈比例为 40%，多肽保留时间过长且与杂质分离度不佳；将乙腈比例提高到 60% 后，多肽能够快速洗脱且与杂质实现良好分离，同时调节 pH 值至 7，进一步改善了峰形和分离效果。

 

四、特殊氨基酸

半胱氨酸（Cys）的独特挑战

半胱氨酸含有巯基，这个小小的巯基犹如一个敏感的“开关”，在碱性条件下极易被氧化。因此，在选择流动相时，必须格外谨慎。如果采用碱性流动相，就如同将半胱氨酸置于危险环境中，为保护巯基不被氧化，务必添加抗氧化剂，为半胱氨酸的巯基披上一层 “防护铠甲”。此外，半胱氨酸的巯基反应活性极高，在不同 pH 值下可能发生二硫键的形成与断裂。这种变化如同对多肽结构进行 “重塑”，会深刻影响多肽的结构与性质。所以，在选择流动相的 pH 值范围时，需要谨慎权衡，确保多肽结构的稳定性，维持其应有的功能与活性。例如，在合成一种含有多个半胱氨酸残基且形成特定二硫键结构的蛋白质模拟多肽时，采用 pH 6 的醋酸缓冲液作为流动相，并添加适量 DTT（二硫苏糖醇）防止巯基氧化，成功得到了具有正确折叠结构的目标多肽。

色氨酸（Trp）的检测考量

色氨酸的吲哚环结构具有较强的紫外吸收特性，这一特性使得在选择流动相时，需要特别关注流动相的紫外截止波长。就如同在黑暗中寻找特定颜色的物体，需要合适的光线条件一样。如果流动相的紫外截止波长不合适，就会像强光干扰视线一样，对色氨酸的检测造成干扰，无法准确获取色氨酸的相关信息。同时，由于色氨酸侧链含有一定极性基团，在流动相选择上要全面综合考量其与多肽整体的相互作用。只有这样，才能实现良好的分离效果，让色氨酸在多肽纯化过程中得以准确识别与分离。在分析一种富含色氨酸的荧光标记多肽时，选用了紫外截止波长较低的乙腈- 水流动相体系，并通过调整 pH 值优化多肽与固定相的相互作用，成功实现了目标多肽与杂质的分离，且准确检测到了色氨酸的荧光信号。

 

五、多肽纯化实际应用

在多肽纯化的实际操作中，杂质的种类和性质千差万别，犹如复杂的迷宫。根据杂质的不同，选择差异性较大的流动相，就如同找到了开启迷宫大门的钥匙，对提高多肽纯化效率具有显著作用。例如，在生物制药领域，生产的多肽药物中可能混杂着结构相似的副产物、未反应完全的原料以及降解产物等杂质。当杂质为酸性物质时，对于富含碱性氨基酸的目标多肽，可选择在反相色谱中使用碱性较强的流动相，利用电荷差异增强目标多肽与杂质的分离效果。若杂质为疏水性较强的物质，对于富含疏水性氨基酸的多肽，可通过调整流动相中的有机溶剂比例，强化对杂质和目标多肽的洗脱差异，实现二者的有效分离。深入掌握氨基酸的特性，并依据这些特性合理选择流动相，是实现高效、高纯度多肽分离的核心关键。通过精心调配流动相，能够精准调控多肽与固定相之间的相互作用，如同指挥一场精密的交响乐，满足不同多肽的纯化需求。无论是在科研实验室中对新型多肽的探索研究，还是在工业生产中大规模的多肽制备，合理运用基于氨基酸特性的流动相选择策略，都将为多肽纯化工作带来更高的效率、更优的质量，推动多肽相关领域不断向前发展。

 

 

来源：药研

关键词： 多肽