摘 要： 建立气相色谱测定琼脂糖微球中司盘85含量的分析方法。通过油酸浓度的换算得到司盘85的含量，以油酸为外标，用气相色谱法进行定量分析。采用DB-FFAP 色谱柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm），载气为氮气，尾吹流量为30 mL/min，进样口温度为240 ℃，采用氢火焰离子化检测器检测，检测器温度为280 ℃，色谱柱流量3.0 mL/min，程序升温。在该色谱条件下，各物质能有效分离，质量浓度在6～100 μg/mL 范围内的线性关系良好，相关系数大于0.99，方法检出限为6.75 μg/mL，定量限为11.25 μg/mL。样品回收率为96.62%～98.84%，测定结果的相对标准偏差小于0.9%（n=6）。该方法克服了待测制剂中其他组分干扰的问题，进一步提高了检测灵敏度和专属性。

关键词： 气相色谱法； 琼脂糖微球； 司盘85； 油酸

 

司盘85又名三油酸山梨坦，是山梨坦与三分子油酸形成酯的混合物，系山梨醇脱水，在碱性催化下，与三分子油酸酯化而制得，或由山梨醇与三分子油酸在180～280 ℃下直接酯化制得，被广泛用作乳化剂、润滑剂、润湿剂、分散剂、增稠剂等，常用于食品、药品、化妆品等领域[1]。

笔者选择司盘85作为乳化剂用于制备琼脂糖微球，搅拌使司盘85与油相充分混合，在乳化过程中油相与水相均匀而稳定地分散混合，从而获得完整且表面形貌良好的球形[2‒4]。制得的乳液经无水乙醇和纯化水洗涤即可得到不含有机溶剂的洁净琼脂糖微球[5]。洁净的琼脂糖微球不仅可以作为介质，用于不同物质的分离和分析[6‒7]，还可以作为载体，应用于医药领域[8]。依据目前中国药典和新药审批规定，需对药物合成中的残留溶剂进行控制，否则产品中的残留溶剂可能会对人体产生危害[9]。司盘85作为一种有机溶剂，其残留量的检测至关重要。

目前，司盘类试剂的检测方法有滴定法、薄层色谱分析方法、高效液相色谱法和气相色谱法。其中，薄层色谱分析方法与滴定法精确度差，适用于定性分析[10]；液相色谱法的灵敏度差，检测过程中出现多个色谱峰，多个色谱峰之间的分离度较差[11]；气相色谱法检测司盘类试剂的处理过程复杂，耗时较长[12]，因此需要一种简单快速检测司盘类试剂的方法。《中华人民共和国药典》（2020年版）四部建议根据脂肪酸组成评估司盘85的含量，但该方法所用对照品较多且操作复杂。

依据油酸在脂肪酸中占比65%~88%，脂肪酸在司盘85中占比85.5%~90%，计算得到油酸在司盘85中占比为0.555~0.792。以油酸为外标，利用气相色谱法检测琼脂糖微球中油酸浓度，再计算出微球中司盘85含量，该方法不仅简便、快速，克服了待测制剂中其他组分干扰的问题，进一步提高了检测灵敏度和专属性。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

精密电子天平：PX224ZH/E型，感量为0.1 mg，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

气相色谱仪：岛津-GC2014C型，配有氢火焰离子化（FID）检测器，日本岛津有限公司。

数显恒温水浴锅：HH-1型，常州丹瑞实验仪器设备有限公司。

油酸：质量分数不低于98%，江西佰草源生物科技有限公司。

甲醇：色谱纯，质量分数不低于99.9%，国药集团化学试剂有限公司。

三氟化硼甲醇溶液：10%，上海麦克林生化科技有限公司。

氢氧化钾、正己烷、氯化钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

高纯氮气：质量分数为99.999%。

琼脂糖微球样品：批号分别为20240108、20240319、20240408，自制。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：DB-FFAP，硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇强极性色谱柱[30 m×0.32 mm，0.5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司]；检测器温度：280 ℃；载气：高纯氮气，流量为30 mL/min；进样口温度：240 ℃；进样方式：分流进样，分流比为38∶1；柱升温程序：初始温度为 150 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升温至220 ℃，保持10 min；平衡时间：3.0 min；进样量：1 μL。

1.3 溶液的制备

油酸标准溶液：称量油酸标准品0.01 g于50 mL离心管中，加入0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液4 mL，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，加正己烷5 mL，加入10 mL饱和氯化钠溶液，摇匀，静置分层后分别取上层液，获得标准溶液。

油酸系列标准工作溶液：分别移取油酸标准溶液30、40、50、100、200、500 μL于10 mL容量瓶中定容，混匀，用0.22 µm滤膜过滤，制备得油酸的质量浓度分别为6、8、10、20、40、100 μg/mL的系列标准工作溶液。

琼脂糖微球：称取4.8 g琼脂糖粉末于160 ml纯化水中，121 ℃灭菌15 min，使琼脂糖粉末充分溶解，作为水相备用。称取20 g司盘85于300 g液体石蜡中，在60 ℃的水浴锅中搅拌30 min，使司盘85与液体石蜡充分混合，作为油相备用。将油相倒入水相中，在60 ℃的水浴锅中进行乳化均质，均质5 min后停止反应，搅拌桨搅拌30 min降温至室温。乳化结束后，将反应液倒入含有乙酸乙酯-乙醇（体积比为7∶3）的清洗液中进行搅拌清洗3次，离心后继续用纯化水清洗3次，筛网过滤得琼脂糖微球[5]。相同方法制备3批琼脂糖微球。

供试品（琼脂糖微球）溶液：精确取琼脂糖微球2.0 g，加入0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液4 mL，在65 ℃水浴中回流10 min，放冷，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，在65 ℃水浴中加热回流2 min，放冷，加正己烷5 mL，继续回流1 min，放冷，转移至50 mL离心管中，加入10 mL饱和氯化钠溶液，摇匀，静置分层取上层液，过滤，获得供试品溶液。

1.4 实验步骤

使用气相色谱仪按照1.2仪器工作条件检测油酸系列标准工作溶液，以溶液质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，建立油酸的标准曲线；同法检测样品溶液，利用色谱峰面积外标法计算出样品中油酸的质量浓度，将所得油酸浓度带入式（1）计算琼脂糖微球样品中司盘85含量：

 

(1)

式中：ρ——样品中司盘85含量，μg/mL；

ρ0——样品中油酸浓度，μg/mL；

w——司盘85中油酸质量分数，0.555～0.792；

m——称取的样品质量，g。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 脂肪酸衍生方法的选择

大多数脂肪酸沸点较高，且在高温条件下不稳定、易裂解，分析过程中容易造成损失，因此需要对脂肪酸进行衍生化处理后才能定量分析[13]。目前常用的衍生化方法主要有酸催化法、碱催化法和重氮甲烷法[14]，而由于重氮甲烷法毒性较强，浓度较高时易发生爆炸，碱催化法易使脂肪酸失去活性，因此选择酸催化法对脂肪酸进行衍生化处理。根据《中华人民共和国药典》（2020年版）四部选择三氟化硼甲醇溶液对脂肪酸进行甲酯化处理。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

目前常用于脂肪酸甲酯化检测的色谱柱为极性固定相色谱柱，比较了聚乙二醇（DB-FFAP）与(88%-氰丙基)芳基-聚硅氧烷（HP-88）对脂肪酸甲酯分离效果。通过试验发现HP-88色谱柱检测时间较长，而DB-FFAP色谱柱对油酸的分离效果较好且检测时间较短，因此选择DB-FFAP色谱柱进行试验。

2.2.2 载气流量的选择

由速率理论可知，载气流量快慢会影响样品中组分分离效果以及峰型，如过高的载气流量会使组分流失，影响测定的灵敏度，过低的载气流量会造成峰拖尾现象[15]。一般载气流量的选择范围为10～100 mL/min。根据多次试验结果和实际色谱柱柱效表明，选择30 mL/min的载气流量为最适流量。

2.3 标准品处理方法调整

根据《中华人民共和国药典》检测三油酸山梨坦的方法，将油酸标准品进行冷凝回流和未回流处理。结果显示，经回流处理的油酸峰面积比未经回流处理的峰面积低，说明冷凝回流会造成标准品的部分损失，故采用不回流的处理方式进行标准品的制备。

2.4 专属性试验

精密量取油酸标准溶液、样品溶液、供试品溶液各1 mL，按照1.4实验步骤进行检测，各溶液的色谱图见图1。

 

  1—供试品溶液；2—标准溶液；3—样品溶液图1　油酸标准溶液、供试品溶液和样品溶液的色谱图

Fig. 1   Chromatograms of oleic acid standard solution、test sample - standard solution and sample solution

由图1可知，3种溶液的保留时间均在同一位置，在目标峰出现的位置确属于待检测的油酸峰，证明该方法的专属性很高，检测过程中不会出现杂峰的干扰。

2.5 线性关系、检测限与定量限试验

按照1.4方法检测油酸系列标准工作溶液，并计算线性方程和相关系数。结果表明，油酸质量浓度在 6～100 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性方程为y=93.973x-304.67，线性相关系数为0.999 2。

以3倍信噪比对应的油酸质量浓度确定检测限为6.75 μg/mL，以10倍信噪比对应的油酸质量浓度确定定量限为11.25 μg/mL。

2.6 精密度试验

配制6份凝胶样品溶液，按1.4实验步骤进行检测，考察微球样品油酸含量和保留时间的相对标准偏差，试验结果见表1。由表1可知，样品中油酸含量测定结果的相对标准偏差为2.92%，保留时间的相对标准偏差为0.07%，表明该方法的重现性很好，具有很高的精密度，能够满足定量分析的要求。

表1   精密度试验结果

Tab. 1   Precision test results

 

2.7 稳定性试验

取1份样品溶液，分别在 0、2、4、6、12、24 h进样测定，试验结果见表2。

表2   稳定性试验结果

Tab. 2   Stability test results

 

由表2可知，油酸峰面积测定结果的相对标准偏差为0.87%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 回收率试验

称取已知组分含量的透明质酸凝胶样品溶液，用标准加入法分别测定20、25、30 μg/mL 3个加标水平下油酸的回收率，每组样品6份，试验结果见表3。由表3可知，油酸平均回收率为96.62%～98.84%，表明该方法的准确度很高，满足样品的分析要求。

表3   回收率试验结果

Tab. 3   Recovery rate test results

 

2.9 样品测定

取适量样品，按照1.3方法制备供试品溶液，在1.2仪器工作条件下测定，计算司盘85含量。结果批号为20240108、20240319、20240408的样品中均未检出司盘85试剂残留。

 

3. 结语

 

通过优化对油酸标准品的处理，利用气相色谱仪对含有司盘85的待测样品进行检测。以油酸为标准品，正己烷为溶剂，通过油酸含量换算得到司盘85的含量。与《中华人民共和国药典》（2020年版）四部相比，该检测方法简化了制备步骤，检测快速，线性良好，克服了待测制剂中其他组分干扰的问题，增强了专属性，对司盘85含量检测具有重要意义。

 

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引用本文： 王宝群，史宇涵，林莎莎，等 . 气相色谱法测定琼脂糖微球中司盘85［J］. 化学分析计量，2024，33（12）：78. (WANG Baoqun, SHI Yuhan, LIN Shasha, et al. Determination of Span-85 in agarose microspheres by gas chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 78.)

 

 

来源：化学分析计量

关键词： 琼脂糖微球 司盘85