药物候选分子进入临床，是从项目立项到找到hit，优化成为late lead，最后成为PCC，从而进入药物开发阶段，之后开展为人熟知的IND enabling毒理相关试验，用于支持首次人体临床。如果该候选分子在临床试验中开发顺利，那么相应的用于支持晚期临床试验的其它毒理试验，也会随之启动。进入药物开发阶段的毒理试验有成熟的法规可循，专业的CRO也会提供一些参考和建议，相比之下，候选分子从立项到PCC阶段的早期毒理（discovery toxicology）研究，可能还不够成熟和完善。可能原因包括该阶段毒理检测的灵活性要求比较高，需根据项目探索的目的case by case进行针对性的设计。本文将主要针对这一阶段的毒理试验进行概述性地讨论。

 

从非临床安全性方面考虑，在项目立项时，需了解该项目拟将用于肿瘤还是非肿瘤适应症，这将决定候选药物分子的优化策略以及在安全性风险评估中能容忍的限度。在安全性风险评估中基本围绕两个方面进行，1）on-target潜在药理相关的作用；2）off-target与候选药物分子结构相关的非预期的作用。这些用于候选药物的评估通常按照一定的层级进行筛选和检测。一般来说，将以高通量的in silico和/或者in vitro assay作为第一或者第二层筛选，标记具有潜在风险的化合物，接着用生理相关的in vitro或者in vivo模型证实这些发现的风险。将这些模型得到的多终点的数据进行整合，利用WOE来分析表征以上风险并定义他们临床转化的相关性。

 

一、on-target潜在药理相关的作用

 

这一部分的评估主要是针对确定靶点的潜在风险，并基于该候选分子拟用适应症综合进行评估，且通常开始于项目立项阶段。在这一阶段，还没有合适的tool compound可用于探索。因此，该阶段的评估主要来源于文献、数据库以及公司内部生物学专家已有的发现。主要关注靶点在体内的分布情况，cross-species同源性以及其生理作用。

 

在进行靶点体内分布分析时，需注意靶点在人体和动物种属间表达的差异，以免引起over-predicting（靶点在人体内不表达）或者under-predicting（靶点在人体内表达而不在动物体内表达）。分析蛋白质序列的相似性也是非常有帮助的，特别是药物结合位点的蛋白序列，帮助理解该靶点的生理作用从而建立相关药物模型进行探索，也可以了解是否这一靶点的生理作用具有种属差异，同时也可为后面的动物毒理试验种属的选择提供有价值的参考。另外，评估不同种属中靶点的potency也是非常重要的，可用于了解靶点相关毒性的therapeutic index，并用于解释毒理试验中的一些发现。

 

在研究成年群体中靶点抑制的潜在作用时，inducible KO模型的数据是非常有价值的。这种模型通常利用tamoxifen-或者tetracycline-引起的Cre-lox system使目标蛋白失活，而对蛋白在多蛋白复合物的作用影响很小，这也使得该模型在模拟靶点药理抑制作用方面最为相关。研究在动物试验甚至人体试验中的毒理发现的机制，KO模型也非常有帮助。如果在KO模型中出现的表型与动物实验中的一些特定的毒性反应一致，那么极有可能该毒性反应与靶点相关；同样如果该毒性没有在KO模型中看到，这是一个很强的证据说明该毒性作用来源于靶点。相反如果在KO模型中发现这一特定毒性反应，这可以说明该毒性是脱靶作用。

 

二、off-target与候选药物分子结构相关的非预期的作用

 

对于候选分子在安全性风险方面的优化，评估由化学结构带来的off-target毒性是非常重要的。安全性风险方面的优化，可与药效，药代动力学方面的优化平行进行。我们主要可以从以下四个方面来进行考虑。

 

1）selectivity/promiscuity （secondary/safety pharmacology）；2）intrinsic cytotoxicity；3）ADME-based drivers of toxicity；4）genetic toxicity (genotoxicity)

 

找到高选择性的候选分子，这些分子应具有最小的可转化体内作用，最小的细胞内源毒性，以及可接受的ADME性质（最小化的化合物反应性和蓄积）。对于非肿瘤适应症，需避免具有致突变性或者染色体异常的候选化合物分子，但可以考虑继续开发引起非整倍体的分子，不过这也取决于预测的临床安全窗。这四个方面的筛选先后顺序在项目实际中的应用策略取决于项目的需要，并不是一成不变的。对于intrinsic cytotoxicity和ADME-based drivers of toxicity，很大程度上取决于化学结构及其吸收代谢和特定的靶器官毒性筛选，因此在本文中不进行详细阐述。这里将重点讨论selectivity/promiscuity的筛选。

 

通常我们采用in vitro secondary pharmacology screening panel来评估selectivity和promiscuity。目前有很多CRO公司均提供这种商业化的screening panel来支持筛选。这些ligands panel可根据公司内部研发经验或者疾病领域进行定制化，可针对于靶点分子相关或者评估特定靶器官作用，如CNS，cardiovascular等等。 Promiscuity和selectivity有细微的差别。Promiscuity是评估一个分子结合其他靶点的倾向性，而selectivity是针对特定的off-target能达到多少倍的安全系数。值得注意的是，在预计的临床有效剂量范围内，这个分子可视为具有高选择性，但是在毒理试验中，高剂量给药将使得药物在体内具有高暴露量，从而也将达到off-target的作用范围，引起非预期的毒性反应。对这些可能的作用进行充分了解也有利于毒理试验中毒性反应的解释。 对化合物promiscuity和selectivity的总体评估基于其在检测组合中的整体结合率（“命中率”）；同时，这些筛选实验也会评估与特定内源性配体结合相关的潜在问题。有文献将化合物的“靶标命中率”（THR）定义为：在10 μM浓度下抑制率>50%的靶标数量与测试靶标总数的比值。其中，“Highly promiscuous化合物的THR≥20%，而“selective”化合物的THR≤5%。当化合物被定义为“promiscuous”，如果公司从战略考虑仍将继续推进该化合物的开发。在此情况下，毒理学家应针对从screening panel中识别的特定靶标进行后续分析。这些分析包括，评估脱靶结合的药理学效应，通过基于细胞的表型分析、离体组织实验或体内研究，确定其活性类型（如激动剂或拮抗剂）；分析暴露量-效应关系。

 

文献中报道，Genentech内部针对小分子的promiscuity和selectivity的评估和决策，可综合采用以下方法：

 

1.化学家需与毒理学家合作，在设计分子时注意那些需要理化特征，从而在所有类药性参数间取得平衡。

 

2.采用体外配体结合实验（screening panel），对各类化学结构系列的代表性分子进行筛选，以评估配体相互作用比率，并针对特定配体评估其潜在功能。

 

3.评估可用于确定与体外生理活性或体内药效相关的预期安全窗。

 

值得注意的是，体外配体结合实验无法反映生理功能（如激动或拮抗作用），且结合也不一定会转化为药理作用。因此，对于将可能继续开发的分子，需通过后续功能性实验来评估临床转化风险：即利用基于细胞的实验、离体器官实验（如主动脉环收缩性或悬吊心脏模型），或在已知靶标种属转化性或相关性的情况下进行体内研究，来进一步验证体外结合配体的功能。

 

三、讨论

 

对这些鉴定出来的或者潜在的风险进行研究，对风险提示和决策制定都非常有必要的。因此需要毒理学家在药物的早期发现和开发过程中，对这些研究工作，投入大量的时间和精力。

 

早期毒理研究的目的主要包括两方面：1）确定毒性原因（on-target or off-target），为化学设计、back-up策略或对于该靶点的持续可行性提供依据；2）评估并表征临床转化风险，包括潜在安全性生物标记物的鉴定和暴露-效应关系。

 

对靶点毒性的分析，通常在对靶点安全性评估（TSA）过程中，发现其潜在的不良药理作用，或是基于对竞品化合物或同类靶点/药物在非临床或临床阶段观察到的不良反应的分析。此外，靶器官毒性也可能在药效学、药代动力学或探索性毒性研究过程中显现。早期毒理研究通常涵盖以下核心内容：区分on-target与off-target效应及作用机制、种属间转化性评估、可监测性（安全性生物标志物的鉴定）以及毒性可逆性分析。为辨别on-target与off-target的效应，可采用结构迥异的"工具"分子和/或结构相似但无药理活性的分子与目标化合物进行对比，通过在动物模型，如在转基因啮齿动物模型中通过分析两种分子的相似或不同的毒性反应，来初步确定on-target作用。

 

当在体内实验中发现靶器官毒性时，评估其临床转化的可能性成为研究重点，但这一过程通常面临重大挑战。该研究需满足两个条件：靶器官毒性在两种种属中均存在，同时通过体外靶器官的跨种属敏感性评估来预测临床转化风险。体外研究通常采用组织学鉴定的靶器官细胞类型，既用于评估种属间毒性表现的差异性，又可探究从细胞机制上探索毒性的产生。这些研究成果可用于建立潜在的构效关系，或基于细胞机制（如线粒体毒性作用）识别临床上可能会给患者带来的风险因素。

 

通过整合一系列的分析，可以帮助预测动物实验中未能预见的人体毒性；对靶点毒性的全面分析，可以促使该靶点从研发管线中剔除；阐明潜在由化合物的化学性质带来的毒性反应，可以帮助筛选出更好的back-up分子；明确毒性的作用机制，如药物相关性血小板减少症和中性粒细胞减少症，可以帮助临床试验设计，并开发出能减少临床药物不良反应的候选药物。

来源：药理毒理开发

关键词： 候选药物分子 毒理