1.初步认识洋葱伯克霍尔德菌

洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia，简称B.c，下同) 属于革兰阴性杆菌，直径约为0.8~1.0μm，长度约为1.6~3.2μm，具有多根极端鞭毛，需氧非发酵菌，是植物病原菌。

 

1950年，康奈尔大学教授Burkholder首次在腐烂的洋葱根茎中分离，分离之初被命名为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。1992年，Yabuuchi等通过多相分类学，依据16S rRNA序列、DNA-DNA杂交同源性、表征特征和脂肪酸组成等，该菌被重新分类命名为洋葱伯克霍尔德菌。

图1 扫描电子显微镜下的洋葱伯克霍尔德菌

随着分子生物学的飞速发展，1997年，Vandamme等通过生化分析表明128株B.c被鉴定为若干菌株，被划分为至少5个不同的基因型。同年5月召开的B.c国际工作组会议上，提议将上述表型特征近似的基因型亚群命名为洋葱伯克霍尔德菌群(Burkholderia cepacia complex，简称Bcc，下同) ，隶属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。

截止至2021年，已被分类命名的Bcc成员达到了24种 ，具体见图2-1、图2-2所示。

图2-1 洋葱伯克霍尔德菌群已分类命名种

Bcc菌种归属：细菌界→变形菌门→β-变形菌纲→伯克氏菌目→伯克氏菌科→伯克氏菌属→洋葱伯克霍尔德群（代表菌种为B.c）。

图2-2 洋葱伯克霍尔德菌群已分类命名种

那洋葱伯克霍尔德菌群（Bcc）和洋葱伯克霍尔德菌（B.c）到底是什么关系呢？这个分类又该如何理解呢？

我们可以用很常见的歌曲专辑来打个比方：一张专辑下包括许多首歌曲，往往这些歌曲中，至少会有一首主打歌，主打歌的旋律总会让我们不经意间就会哼唱起来。B.c就是Bcc的“主打歌”，只不过是“主打歌”和“专辑”几乎同名了而已。B.c也是实验室经常会用到的菌种。

从ATCC官网上可以查到，目前在售的一共有四种B.c，不同的菌种号代表不同的提取来源，如图3所示。其中ATCC 25416被标记为标准菌株，提取于洋葱中。该菌也是目前化妆品试验以及我司实验室的常用菌株。

图3 ATCC在售B.c菌种（来自ATCC官网）

CTFA的日化产品防腐效能评价测试方法中，把菌号为ATCC 25416的洋葱伯克霍尔德菌作为革兰氏阴性杆菌（不产气）中的可选菌株，如图4所示，可根据需求选取该菌对相应产品进行防腐挑战测试。

图4 CTFA Microbiology Guidelines 2007试验菌株

 

2.洋葱伯克霍尔德菌群多样化的生存环境

众多文献表明，Bcc在自然界中是很常见的，广泛分布于土壤、水、植物的根周外等等。比如：

《非无菌药品中不可接受微生物的控制与风险评估》中写到洋葱伯克霍尔德菌广泛存在于自然界如土壤、水、植物根际和农产品中。该菌能够在寡营养的条件下如纯水中存活，甚至在12℃或48℃条件下仍然能够生长繁殖。在管道中常常形成生物膜，并且无规律地从管道内壁脱落，导致微生物检测中出现不均匀污染现象；

《<中国药典>拟收载洋葱伯克霍尔德菌群（Bcc）检查法中标准菌株的稳定性研究》中写到Bcc生存能力强，在土壤、水和植物根际等自然环境中广泛存在，对营养需求较低，能在蒸馏水中存活数月，容易在制药用水中驻留并形成生物膜，最终引入产品；

《化妆品生产中抗性环境菌株的研究》中写到伯克霍尔德菌属可以在营养极低的环境中生长，广泛存在于土壤和水中；

《一株样品分离菌-洋葱伯克霍尔德菌对抑菌效力评价体系的启示》中写到洋葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性菌；

《饮水中洋葱伯克霍尔德菌的分离鉴定及消毒剂灭活试验》中写到洋葱伯克霍尔德菌广泛存在于水、土壤、植物和人体中，是一种机会致病菌等等。

 

更有文献表明，Bcc对部分抗生素、消毒剂和抑菌剂具有天然抗性。比如：

《中国卫生检验杂志》收录的文献中写到在罐装24h后的矿泉水中检出洋葱假单胞菌；

《Journal of Infection》收录的文献中写到一株洋葱假单胞菌在0.05%苯扎氯铵作为抗菌剂的无机盐溶液中作为污染物存活了14年(1963~1977年)；

《预防医学文献信息》收录的文献中写到在洗发膏中检出洋葱假单胞菌；

《抗感染药学》收录的文献种写到在含有尼泊金酯的抗真菌乳膏中检出洋葱伯克霍尔德菌群；

《中国卫生检验杂志》收录的文献中写到在0.1%洗必泰消毒剂中检出一株洋葱假单胞菌等等。

 

可见Bcc强大的代谢能力支持它适应不同的环境，由该菌引起的污染事件时有发生。目前该菌已经被FDA明确为不可接受微生物(objectionable microorganism)，我国药品评审中心在2021年发布的“化学药品创新药上市申请前会议药学共性问题及相关技术要求”中明确规定水基质非无菌制剂应开展洋葱伯克霍尔德菌研究，并制定相应的控制策略，中国食品药品检定研究院承担了“洋葱伯克霍尔德菌群检查法的建立”课题，如图8、9所示。

 

图8 我国药品评审中心在2021年发布的“化学药品创新药上市申请前会议药学共性问题及相关技术要求”

 

3.洋葱伯克霍尔德菌群的危害

Bcc是一种条件致病菌（比如大肠杆菌就是很常见的条件致病菌，正常情况下大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，属于互利共生关系，但在一定条件下，比如免疫力下降、菌群失调等也会引发一些疾病），对健康群体通常不致病，主要在免疫功能低下的人群中引起疾病。可以定殖于患者呼吸道，导致囊性纤维化患者或免疫力低下患者不同程度的肺部感染。

1980年，美国某吸入剂生产企业由于去离子水制备系统控制失败，致使产品污染洋葱伯克霍尔德菌，导致数名囊性纤维化(Cysticfibrosis，CF)患者死亡。也因此事件，FDA（Food and Drug Administration）开始关注该菌。

近年来，不断有因为药品和卫生用品在内的健康产品污染Bcc而召回的案例，FDA也因该菌的疑似污染，发布若干次警告信息。

2017年，FDA发布关于建议水基质的非无菌药品制造商应关注由Bcc造成的微生物污染风险。

2019年5月15日，Skyn Iceland 卸妆水在全国范围内自愿召回，召回原因为产品中检出洋葱伯克霍尔德菌。

2021年1月17日，Scent Theory Products Llc 泡沫洗手液在全国范围内自愿召回，召回原因为产品可能被洋葱伯克霍尔德菌污染。

2022年4月13日，PM Concepts LLC爽肤水在全国范围内自愿召回，召回原因为产品被洋葱伯克霍尔德菌污染。

我们统计了从2018年至今FDA关于化妆品的召回信息。在118种召回化妆品中，有73种化妆品因为微生物污染被召回。其中又有31种与洋葱伯克霍尔德菌污染有关，约占因微生物污染召回事件的42%。召回的产品包括化妆水、卸妆水、漱口水、洗发液、洗手液等。如图10、11所示。

图10 2018年至今FDA关于化妆品的召回信息统计

图11 化妆品召回信息（来自FDA官网）

因此Bcc的预防及防控对湿巾及化妆品厂家至关重要。

 

4.如何鉴别洋葱伯克霍尔德菌群

不同鉴定方法能达到的鉴定水平是有差异的， Bcc可参考的标准方法，包括《SN/T 4684-2016 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》、《SN/T 4485-2016 进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》、《USP <60>非无菌产品的洋葱伯克霍尔德菌群检查》，这三种方法均为选择性培养，适用于菌种的初步鉴定。如果要具体甄别到属于Bcc的24个菌种中的哪一个，比如确定污染菌是否为B.c（洋葱伯克霍尔德菌），这需要进行深一步的基因序列鉴定及分析。

 

由于不同行业对于鉴定的应用需求是不同的，目前这三种检测方法可以满足化妆品或者湿巾行业的基本需求，也是目前最为常用的方法。具体检测流程见图5所示。Bcc可能存在的指示特征是在 BCSA 上生长带黄色光晕的绿棕色菌落或被粉红色区域包围的白色菌落。

图5. 各标准进行Bcc检验的流程

 

5.工厂如何防控洋葱伯克霍尔德菌群

对于Bcc的防控，我们先看看Bcc的生长习性。

 

1）工厂消杀管理制度及流程设计有无缺陷环节；

2）人员、机器、原料、环境等清洁及消毒是否存在不到位，管理是否有欠缺（比如：设备干燥时间不够、中间料体储存不当、最终产品灭菌不充分）；

3）水系统设计（比如：死水中更容易产生生物膜）；

4）生产用水控制如何，是否定期维护，是否能达到净化要求等级；

5）对关键产品表面和设备处理程序的验证或环境监测是否合理；

6）微生物测试及分析是否及时、全面。

 

其中最重要的环节是对生产用水的微生物质量控制。

 

除了上述Bcc防控措施，在进行工厂消杀时，有没有抗抑菌剂数据可以参考？

 

研发产品配方时，选用什么体系更好的预防和保护产品呢？

 

6.哪些抗抑菌剂对洋葱伯克霍尔德菌群有作用

我们从文献中也见到过消毒剂及不同温度热水对Bcc的杀灭作用。比如暴露于0.5%洁尔灭15s内、0.1%烷基二氨基乙基甘氨酸1min内，菌悬液中Bcc生存率降到0.001%或更低；暴露于0.1%洁尔灭或0.5%葡萄糖酸洗必泰60min后，存活率降到原来的0.1%；暴露于65℃及以上热水中15s后，菌悬液中的Bcc即可被杀灭。

 

除上述文献数据，我公司微生物实验室利用自身优势，持续对该菌进行关注。下面分别以化妆品相关的微生物试验以及我司实验室的常用菌株B.c（即ATCC 25416）以及受洋葱菌污染的产品为例，通过抑菌环试验，评估不同的抑、杀菌剂对B.c的功效，从而更好地指导工厂进行防控。

 

备注：

 

1、抑菌环试验是利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。抑菌环大于7mm，则有抑菌作用。

 

2、参考方法：《消毒技术规范》（2002年版）2.1.8.2抑菌环试验

 

3、产品污染菌*指从客户受污染产品中分离出的菌群（经菌种鉴定，包括洋葱伯克霍尔德菌、伯克霍尔德菌属等）

 

从以上抑菌环数据中可以看出，目前常见的抗、抑菌剂对B.c都是有抑制作用的，其中桑普® BC（苄索氯铵）、桑普® LPC（月桂基吡啶氮鎓氯化物）、桑普® CHD-G（葡萄糖氯己定）的效果都很不错。在湿巾配方研发中，可以选择加入这些杀菌剂，增强产品对B.c的防控作用。

 

像过氧化氢、酒精这类常用于环境消杀的产品，对B.c的抑制作用也很明显，在抑菌环试验中75%酒精的平皿甚至已接近透明，如图6所示（实验室数据）。所以在工厂日常消杀工作中，可以选择这类产品进行消杀工作。

 

图6. 使用75%酒精进行抑菌环试验的平皿

 

但从受洋葱菌污染的产品情况与单纯B.c结果来看，数据相差甚大。这是为什么呢？

 

其实我们在上期内容中提到已被分类命名的Bcc成员达到了24种（见上期图2、3），在进行产品污染菌鉴定中，极少或者不可能出现单一的、纯化的菌种污染。但目前化妆品试验以及我司实验室的常用菌株选取的其中一种，即ATCC 25416，它被ATCC标记为标准菌株。并且鉴于菌种不断扩大及鉴定能力等原因，并不是每种Bcc成员都可以被精准无误的确定命名。

 

与其纠结到底哪种防腐杀菌剂对Bcc有作用，不如做好工厂的微生物防控，包括人员、机器设备、原料（尤其是水）、环境、管理制度等等，从源头把关，控制好每个环节和流程，最大限度地减少微生物污染事件发生！

 

7.写在最后

Bcc这么可怕吗？那我们岂不是很容易就被感染了？

 

放心吧！一般健康人并不是Bcc的菜，接触到了也不一定会感染。就像上期谈到的，Bcc是一种条件致病菌（比如大肠杆菌就是很常见的条件致病菌，正常情况下大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，属于互利共生关系。但在一定条件下，比如免疫力下降、菌群失调等才会引发一些疾病），主要在免疫功能低下的人群中引起疾病。易感染的特定人群包括老年人、幼儿、癌症患者、孕妇和慢性病患者。Bcc很少引起健康人的呼吸道感染，这是因为健康人的气道黏膜纤毛功能是正常的，可以将Bcc从呼吸道中排除。

 

来源：Internet

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