近期，国家食源性疾病监测系统陆续接报多起由产气荚膜梭菌引起的食源性疾病暴发事件，通过归因分析，特作以下风险提示：

 

1.什么是产气荚膜梭菌？

 

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于污水、土壤等环境及人和动物肠道中。产气荚膜梭菌既有“荚膜”护体，又可产生“芽胞”休眠，可以抵抗高温、冷冻、高压等各种环境不利条件，待到适宜的生存条件时，便可结束休眠状态，繁殖产毒。

 

2.产气荚膜梭菌的危害是什么？

 

产气荚膜梭菌具有异常迅速的生长繁殖能力，可分泌多种毒素，不同毒素可引起特定的疾病和症状，临床症状表现为腹泻、腹部痉挛性疼痛、胀气，每日腹泻次数可高达十余次，水样便或稀便，伴腐败性恶臭，呕吐、恶心、头痛症状较少见，一般不发热。重症者有虚脱、痉挛、意识障碍及肠出血、坏死等症状。潜伏期一般为2~36小时，症状多于48小时后缓解，除老幼体弱者外往往预后良好。

 

3.高危食品和危险因素有哪些？

 

产气荚膜梭菌是一种食源性人畜共患病致病菌，可通过污染鸡、鸭、猪、牛、羊等动物性食品经食物链传播给人，夏、秋季节高发。我国高危食品以集体供应的批量烹饪肉类食品为主，包括鸡、鸭和肉酱（汁）等，高危因素主要为烹饪不彻底、缓慢冷却、生熟交叉污染。

 

4.如何预防产气荚膜梭菌污染？

 

预防产气荚膜梭菌污染的关键是“充分加热、快速冷却、避免污染”。肉类等高风险食品需彻底煮熟，确保中心温度≥70℃，并持续1分钟以上；在室温下存放不得超过2小时，应及时低温冷藏，大量烹饪的食品应分装为小份，快速降至4℃以下，再食用时应彻底加热；避免生食与熟食交叉污染，厨具应洗净消毒后使用，注重厨房卫生。

 

GB 4789.13-2012 产气荚膜梭菌检验

 

1、产气荚膜梭菌的生物学特性

 

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringen）是一种广泛存在于自然界的厌氧革兰氏阳性杆菌，常见于土壤、污水及食品基质中。该菌还是人和其他动物胃肠道微生物群的组成部分，属于条件性致病菌。在临床上，该菌不仅与人类及动物的气性坏疽发生密切相关，还可引发食物中毒、非食源性腹泻、坏死性肠炎以及肠毒血症等多种消化道疾病。研究发现该菌的致病性主要依赖于其产生的外毒素和酶，并根据其产生的外毒素类型可将其分为A、B、C、D、E、F和G七种类型。

 

2、GB4789.13-2012 产气荚膜梭菌的检验

 

2.1 培养基和试剂

 

胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂

 

液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）

 

缓冲动力-硝酸盐培养基

 

乳糖-明胶培养基

 

含铁牛乳培养基

 

0.1%蛋白胨水

 

革兰氏染色液

 

硝酸盐还原试剂

 

缓冲甘油-氯化钠溶液

 

2.2 检验程序

 

图1 产气荚膜梭菌检验程序

 

2.3 样品制备

 

2.3.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

 

2.3.2 以无菌操作称取25g（mL）样品放入含有225mL0.1%蛋白胨水（如为2.3.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，作为1:10稀释液。

 

2.3.3 以上述1:10稀释液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制备10-2～10-6的系列稀释液。

 

2.4 培养

 

2.4.1 吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

 

2.4.2 上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。

 

2.4.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养20h～24h。

 

2.5 TSC琼脂培养基及产气荚膜梭菌典型菌落特征

 

胰胨、大豆胨和酵母粉提供细菌生长所需的碳源、氮源、维生素等营养元素；焦亚硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；D-环丝氨酸抑制非梭菌的细菌；琼脂是培养基的凝固剂。

 

典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。使用君立康动态菌落计数仪对TSC琼脂平板上培养结束的产气荚膜梭菌进行拍照及计数，可实现抗笔记干扰的精准计数和对检验结果的数据留存。

 

2.6 确证实验

 

2.6.1 从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18 h～24 h。

 

2.6.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36 ℃±1 ℃厌氧培养20h～24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h，用于后续的确证试验。

 

2.6.3 取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。

 

2.6.4 用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

 

2.6.5 用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。

 

2.7 结果与报告

 

2.7.1 典型菌落计数

 

选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：

 

a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；

 

b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；

 

c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

 

d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

 

e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。

 

2.7.2 结果计算

 

计数结果按下列公式计算：

 

式中：

 

T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；

 

A——单个平板上典型菌落数；

 

B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；

 

C——单个平板上用于确证试验的菌落数；

 

n1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

 

n2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；

 

0.1——稀释系数；

 

d——稀释因子（第一稀释度）。

 

2.7.3 报告

 

根据TSC琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照2.7.2中公式计算，报告每g（mL）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

 

文章来源：国家食品安全风险评估中心、GB 4789.13-2012

 

来源：Internet

关键词： 产气荚膜梭菌