摘 要： 建立顶空气相色谱-质谱法测定交沙霉素及其制剂中遗传毒性杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）的含量。样品采用二甲亚砜溶解，色谱柱为DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温，进样口温度为220 ℃，载气为高纯氦气，恒流模式，流量为1.0 mL/min，顶空平衡温度为130 ℃，平衡时间为20 min。采用电子轰击源（EI），电离能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，检测模式为多反应监测模式。NDMA在质量浓度为2.467～49.330 ng/mL时与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 8，检出限为4 ng/g。样品加标回收率为95.64%～117.50%，测定结果的相对标准偏差为8.3%（n=6）。初步分析NDMA来源于原料生产过程，提示原料生产企业关注物料的质量及工艺的优化。该方法准确灵敏、专属性强，可用于交沙霉素及制剂中遗传毒性杂质NDMA的质量控制。

关键词： 交沙霉素； N-亚硝基二甲胺； 顶空气相色谱-质谱法； 遗传毒性杂质

 

N-亚硝基二甲胺(NDMA)属于N-亚硝胺类遗传毒性杂质，具有强致癌作用和明显的肝毒性[1‒2]。近年来，NDMA陆续在沙坦类药物、雷尼替丁中检出，严重影响了药物的安全性。根据国际人类用药技术要求协调会（ICH）发布的指导原则中对遗传毒性杂质的分类，亚硝胺类化合物属于高效致突变致癌物(关注队列)。亚硝胺类杂质有多种来源，如工艺产生、降解途径和污染引入等。有报道指出含有二甲胺官能团的叔胺和季胺可以降解生成NDMA[3‒4]。交沙霉素为大环内酯类抗生素，其化学结构中含有二甲胺的结构，为保证该药物的安全性，有必要对交沙霉素中的NDMA进行分析和控制。目前，交沙霉素中的NDMA的检测方法鲜见公开报道。

美国食品药品监督管理局(FDA)发布的指导意见中，NDMA建议的可接受摄入量为96 ng/d。按交沙霉素每日最大用药1.6 g计算，NDMA限度为60 ng/g，由于限度极低，要求测定方法专属性强、灵敏度高。目前药物中NDMA测定方法主要采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法[5‒8]，进样方式为液液萃取后直接进样或顶空进样。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法[9‒12]也是常用的方法，可避免药物在高温条件下发生降解导致的假阳性。

笔者参考文献[8]，采用二甲亚砜为溶剂，通过优化色谱条件、顶空平衡温度和时间等，建立了灵敏度高、专属性强、定量准确的顶空气相色谱-质谱(HS-GC-MS)法测定交沙霉素及其片剂中NDMA的含量，通过影响因素试验初步分析了NDMA的来源，可为交沙霉素及其片剂中亚硝胺类遗传毒性杂质的控制提供参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

顶空气相色谱-质谱仪：7890B-7000C型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：CPA2250 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高速冷冻离心机：UNIVERSAL 302R型，德国Hettich公司。

甲醇、二甲亚砜：均为色谱纯，德国默克公司。

N-亚硝基二甲胺对照品：质量分数为99.5%，批号为510166-202104，中国食品药品检定研究院。

交沙霉素片：规格0.2 g，批号分别为JN191102、JN200102、JN200204、JN220103、JN230303，A企业。

交沙霉素：批号分别为R220801006、R220801007、R220801008、R220801009，B企业，为A企业制剂使用的原料。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 顶空进样器

顶空平衡温度：130 ℃；平衡时间：20 min；传输线温度：135 ℃；进样时间：2 min。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：DB-WAX UI毛细管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷伦科技(中国)有限公司]；进样口温度：220 ℃；载气：高纯氦气；流量：1.0 mL/min；进样方式：分流进样，分流比为2∶1；升温程序：起始温度为40 ℃，维持0.5 min，以20 ℃/min的速率升温至200 ℃，再以60 ℃/min的速率升温至240 ℃，维持4.5 min。

1.2.3 质谱条件

电离方式：电子轰击电离源(EI)；数据扫描模式：多反应监测(MRM)模式；电离能量：70 eV；接口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；定量离子：质荷比为74，44，碰撞能量为5 eV；定性离子：质荷比为74，42，碰撞能量为18 eV。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的制备

空白溶液：二甲亚砜。

NDMA对照品储备液：质量浓度为500 ng/mL。取NDMA对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至标线，摇匀，精密量取0.1 mL于200 mL量瓶，加二甲亚砜稀释至标线。

NDMA系列标准溶液：精密量取NDMA对照品储备液适量，用二甲亚砜稀释制成NDMA质量浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列标准溶液，精密量取各标准溶液2 mL于20 mL顶空瓶中，密封。

交沙霉素样品溶液：取交沙霉素约0.32 g，精密称定，置于20 mL顶空瓶中，精密加入二甲亚砜2 mL，密封。

交沙霉素片样品溶液：取交沙霉素片20片，精密称定，研磨成细粉，取细粉适量(相当于交沙霉素0.8 g)，精密称定，置于50 mL塑料离心管中，精密加入二甲亚砜5 mL，涡旋2 min，置于高速冷冻离心机中离心10 min (转速为8 000 r/min，温度为5 ℃)，精密量取上清液2 mL置于20 mL顶空瓶中，密封。

1.3.2 样品测定

取交沙霉素样品溶液、交沙霉素片样品溶液上机测定，以保留时间和碎片离子丰度比定性，以标准曲线法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 检测方法和进样方式的选择

目前采用液相色谱法测定药物中NDMA的样品处理方式多为采用有机溶剂溶解药物后直接进样分析，因NDMA限度极低，为了使分析方法的灵敏度满足检测要求，通常需配制较高浓度的样品溶液，大量的药物进入色谱系统会影响方法的准确度和稳定性。笔者采用气相色谱-串联质谱法结合顶空进样方式分析NDMA，可避免大量药物进入色谱系统，减少色谱系统的污染，保证方法的准确度和稳定性。

2.2 色谱条件及顶空平衡温度、平衡时间的选择

考察DB-WAX UI、DB-624和HP-5MS UI 3种不同填料的毛细管柱对NDMA测定的影响，结果表明，采用DB-WAX UI分析色谱柱时目标分析物的峰形最好。考察不同色谱柱流量(1.0、1.5、2.0 mL/min)时NDMA的出峰情况，当柱流量为1.5和2.0 mL/min时，NDMA与干扰峰分离度达不到要求，因此选择柱流量为1.0 mL/min。

考察不同平衡温度(90、110、120、130、140 ℃)平衡20 min对NDMA响应值的影响，发现随着温度升高，响应值变大，但是考虑到平衡温度过高有可能导致NDMA不稳定，因此选择平衡温度为130 ℃。同时考察了在130 ℃下不同平衡时间(10、15、20、25 min)对NDMA响应值的影响，发现在20 min时响应值已达到最大，因此选择平衡时间为20 min。

2.3 质谱参数的优化

在正离子模式下对NDMA进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描，以各子离子的色谱峰峰高为指标，对碎裂电压和碰撞能量进行优化选择。选择两个丰度最高的特征离子作为定性离子，并以其中丰度较高的子离子作为定量离子。

2.4 专属性试验

取空白溶液、标准溶液(10 ng/mL)及交沙霉素片样品溶液进样分析并记录色谱图，见图1。由图1可见，空白溶液在NDMA保留时间相同位置处无干扰峰，表明方法专属性良好。

图1   NDMA测定的典型色谱图

Fig. 1   Typical chromatogram of NDMA

2.5 线性关系考察

取系列标准溶液，分别进样测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，以相应色谱峰面积为纵坐标进行线性回归。NDMA在质量浓度2.467～49.330 ng/mL内与色谱峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y＝662.8x+281.5，相关系数为0.999 8。

2.6 检出限和定量限

精密量取质量浓度为5 ng/mL的标准溶液适量，用二甲亚砜逐级稀释并检测，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限和定量限。定量限为12 ng/g (按交沙霉素标示量计算)，检出限为4 ng/g (按交沙霉素标示量计算)。

2.7 加标回收试验

取批号为JN230303的交沙霉素片细粉适量(相当于交沙霉素0.8 g)，精密称定，置于50 mL塑料离心管中，分别精密加入质量浓度为50 ng/mL的标准溶液1 mL、二甲亚砜4 mL，涡旋2 min，置于高速冷冻离心机中离心10 min (转速为8 000 r/min，温度为5 ℃)，精密量取上清液2 mL至20 mL顶空瓶中，密封，分别进样测定，记录色谱图，根据NDMA峰面积计算回收率和测定结果的相对标准偏差(RSD)，结果见表1。由表1可知，NDMA回收率为95.64%～117.50%，测定结果的相对标准偏差为8.3%，表明该方法准确度和精密度均良好，满足分析要求。

表1   加标回收验结果(n=6)

Tab. 1   Results of standard addition recovery test (n=6)

 

2.8 溶液稳定性试验

取批号JN230303的交沙霉素片细粉适量(相当于交沙霉素3.2 g)，精密称定，置于50 mL塑料离心管中，分别精密加入质量浓度为50 ng/mL的NDMA标准溶液4 mL、二甲亚砜16 mL，涡旋2 min，置于高速冷冻离心机中离心10 min (转速为8 000 r/min，温度为5 ℃)，分别精密量取上清液2 mL置于5只不同的20 mL顶空瓶中，密封，室温条件下放置，分别于第0、2、5、8、10 h进样分析，记录色谱峰面积，计算峰面积平均值的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。由表2可知，NDMA色谱峰面积的RSD为2.0%，表明被测物在10 h内稳定。

表2   NDMA溶液稳定性试验结果

Tab. 2   NDMA solution stability test results

 

2.9 影响因素试验

取交沙霉素片(批号JN230303)和交沙霉素(批号R220801009)，分别在高温(50 ℃)、高湿(温度25 ℃，相对湿度95%)与强光照射(4 500 Lx) 3种条件下分别放置5、10 d。按照试验方法，制备样品溶液并进样分析，结果在3种条件下分别放置5 d及10 d的样品中NDMA含量与0 d相比基本无变化。

2.10 NDMA来源分析

交沙霉素及交沙霉素片在高温、高湿与强光照射条件下放置5、10 d后，NDMA含量均未增加，表明交沙霉素及其制剂在储存过程中不产生NDMA。此次试验未能收集到交沙霉素片的辅料，而交沙霉素片中NDMA检出量与交沙霉素原料接近，因此推测交沙霉素中的NDMA为生产过程中物料引入或工艺杂质，而制剂中NDMA主要来源于原料，提示原料生产企业关注原料生产过程中使用的物料的质量及工艺的优化。

 

3. 结语

 

建立顶空气相色谱-质谱法测定交沙霉素及其制剂中N-亚硝基二甲胺的含量。该方法灵敏度高、专属性强，可准确测定N-亚硝基二甲胺的含量，可为交沙霉素及其制剂中亚硝胺类遗传毒性杂质的控制提供参考。

 

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引用本文： 邓鸣，曾庆花，梁秋霞，等 . 顶空气相色谱-质谱法测定交沙霉素及其制剂中N-亚硝基二甲胺［J］. 化学分析计量，2025，34（2）： 8. (DENG Ming, ZENG Qinghua, LIANG Qiuxia, et al. Determination of N-nitrosodimethylamine in josamycin and its preparations by headspace gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2025, 34(2): 8.)

 

来源：化学分析计量

关键词： 交沙霉素 遗传毒性杂质