细菌培养被广泛应用于生物化学与分子生物学的实验，例如基因克隆与表达、DNA与RNA的提取、酶的生产、细菌与细胞共培养等。下面以基因克隆表达中大肠杆菌（生长周期短）的培养、鸟分枝杆菌（生长周期长）的培养为例分享主要的实验步骤和注意事项：

 

 

2. 实验步骤

2.1 准备工作

（1）培养基准备：LB培养基（大肠杆菌）、Middle brook培养基（鸟分枝杆菌）

（2）试剂准备：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、购买Middle brook 7H10固体培养基和Middle Brook 7H9肉汤培养基、蒸馏水、抗生素（氨苄青霉素、羧苄青霉素、两性霉素B）、购买增菌液。

（3）仪器、耗材准备：细菌培养皿、50mL无菌离心管、试管、锥形瓶、接种环、酒精灯、打火机、高压蒸汽灭菌锅、37℃恒温培养箱、生物安全柜、超净工作台、恒温摇床。

 

2.2 实验步骤

（1）灭菌：按照下面成分（见表1）配置培养基，使用高压蒸汽灭菌法121℃、30min进行灭菌处理。接着将准备的细菌培养皿、50mL无菌离心管、锥形瓶、接种环、酒精灯等物品放置在超净工作台打开紫外线照射至少30min。

（2）培养基配置比例：培养基的配置需要按照质量比例要求例如LB培养基需按照质量（g）比（2:1:2）分别称取蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，购买的分枝杆菌培养基按照说明书根据使用的量进行配置。固体培养基的配置加入琼脂粉一般按照15.0 g/L的比例加入。

（3）倒平板：根据细菌的生长状况设置平板的厚度，培养基的量通常的大肠杆菌10mL/平板（培养基层厚度约3-4mm），而分枝杆菌需要20mL/平板（培养基层厚度约5-6mm）。

（4）活化、接种：菌种的来源可以是涂布的平板也可以是保存在-80℃的菌种。关闭紫外线，打开超净工作台通风，点燃酒精灯，将接种环放置在酒精灯上灼烧至红色，放置在火焰周围冷却。挑取适量菌落或者菌液进行划线，使得菌液以多至少的量（图1）分布在培养基表面。

（5）培养：可将处理好的培养基用封口膜封闭好，正置37℃恒温培养箱30min左右，然后倒置培养。

（6）观察：按照细菌的生长周期观察期生长状况，大肠杆菌一般需要12~16h，而分枝杆菌生长缓慢需要1~4周左右。

（7）液体培养：一般在活化、接种后，划线的平板长出清晰的单克隆菌落，此时我们可以挑取单菌落进行扩大培养。将液体培养基按15~20mL的量倒入无菌离心管或者10mL左右倒入试管，在灼烧接种环灭菌冷却后将菌落挑取伸入试管轻轻晃动，使菌落落入液体培养基，封口膜封闭试管或者离心管；最后放置恒温摇床进行培养。

 

3. 注意事项

（1）细菌培养要求所涉及的物品、操作均要求无菌，否则会存在其他杂菌的污染。

（2）灭菌之前注意按照菌的生长情况调节培养基的pH值例如LB培养基要求PH值在7.0~7.4之间，防止偏酸或者偏碱的环境影响菌的生长。

（3）培养基配置时，使用蒸馏水充分溶解；灭菌完成后，固体培养基可以暂放烘干箱后倒平板。

（4）抗生素、增菌液一定是等待培养基稍稍冷却至手可以正常触碰锥形时加入，否则抗生素会失效。

（5）所使用的的物品基本上放置在酒精灯的周围，例如倒平板时，灼烧瓶口后一手操作平板一手操作锥形瓶倒平板（图2）。

（6）为了防止平板产生水汽，可以将平板半敞开在酒精灯周围，也可以全部叠放在酒精灯的旁边（图3）。

（7）分枝杆菌生长周期长，需要按照说明书的比例加入增菌液、抗生素以及倒厚平板，保证长时间的培养有足够营养成分和良好的生长环境。

（8）鸟分枝杆菌属于非结核分枝杆菌，存在一定的感染性，使用前需要用60℃水浴灭活30min，同时在生物安全柜中进行操作，防止感染。

（9）在实验操作过程中，需佩戴好手套、口罩、穿好实验服等。

（10）平板处理，有一定感染性的平板需要集中灭菌处理后再丢弃。

（11）注意标记平板，一般标记好时间、菌种名称、培养条件等。