一、概述

针对病毒和细菌样本，其裂解方式的选择至关重要，直接关系到下游应用（如核酸提取、蛋白研究）的成功与否。

以下将分别针对病毒和细菌，详细说明其常用的裂解方式及相应的优缺点。

 

二、病毒样本的裂解

病毒结构相对简单，主要由核酸（DNA或RNA）和蛋白质衣壳构成，有些病毒还具有脂质包膜。裂解的目的是打破蛋白衣壳，释放内部的核酸。

常用裂解方式

1.  化学裂解法（最常用）

原理：使用变性剂（如离液盐）和表面活性剂（如SDS）破坏蛋白质的二级结构，溶解衣壳。

常用试剂：

离液盐：盐酸胍（Guanidine HCl）、异硫氰酸胍（Guanidine isothiocyanate, GITC）。强烈变性蛋白质，并抑制核酸酶（RNase/DNase）活性，对RNA病毒尤为重要。

表面活性剂：SDS（十二烷基硫酸钠）、Triton X-100、NP-40。破坏脂质双分子层和蛋白疏水相互作用，能有效裂解有包膜病毒。

碱裂解法：如NaOH。强效但破坏性强，可能损伤DNA（对RNA病毒或短片段PCR影响较小）。

优点：

高效快速：能在几分钟内完成裂解。

高通量：易于实现自动化，是商业核酸提取试剂盒的核心组成部分。

同时灭活：许多化学裂解液（如含GITC的AVL缓冲液）能瞬间灭活病毒，大大降低生物安全风险。

缺点：

抑制剂残留：裂解液成分（如SDS、胍盐）如果清除不彻底，会强烈抑制下游的PCR反应。

核酸损伤风险：特别是碱裂解法，可能造成核酸断裂。

不适合蛋白研究：蛋白质已变性，无法用于天然蛋白（如抗原、抗体）的分析。

2. 物理裂解法

原理：通过机械力或温度变化来破坏病毒结构。

常用方法：

加热法：95-100°C煮沸5-10分钟。简单粗暴，能有效裂解大部分病毒并灭活核酸酶。

反复冻融：在-80°C（或液氮）和37°C（或室温）之间循环3-5次。通过冰晶形成和融化破坏衣壳。

优点：

极其简单：无需特殊试剂，成本极低。

无化学添加剂：裂解产物干净，几乎无PCR抑制剂引入。

缺点：

效率不均一：对某些结构坚固的病毒（如腺病毒、轮状病毒）效果不佳。

潜在生物安全风险：简单的加热或冻融可能无法完全灭活所有病毒。

核酸片段化：煮沸可能导致核酸，尤其是大片段DNA，发生断裂。

3.酶裂解法

原理：使用蛋白酶（如Proteinase K）降解病毒衣壳蛋白。

优点：

温和：能释放出完整的长片段核酸，适用于基因组测序。

高效：对结构复杂的病毒颗粒非常有效。

缺点：

耗时长：通常需要50-60°C孵育30分钟以上。

需要后续灭活：Proteinase K需要加热（如95°C）灭活，否则会降解下游实验中的酶（如Taq酶）。

成本较高。

病毒裂解策略总结表：

 

三、细菌样本的裂解

细菌结构复杂，有坚韧的细胞壁（肽聚糖层）和内部的细胞膜。革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁结构差异巨大，因此裂解难度和方法也不同（G+菌通常更难裂解）。

常用裂解方式：

1.  酶裂解法（温和）

原理：使用酶解细胞壁的酶，再结合表面活性剂裂解细胞膜。

常用试剂：

溶菌酶（Lysozyme）：针对肽聚糖层，对G-菌效果更好（因其肽聚糖层较薄且暴露）。处理G+菌常需添加EDTA来螯合镁离子，破坏细胞壁稳定性。

lysostaphin（针对葡萄球菌）、mutanolysin（针对乳杆菌、链球菌）等特异性酶。

优点：

非常温和：能很好地保持核酸（尤其是大质粒DNA）和细胞内蛋白的完整性。

可控。

缺点：

耗时长：通常需要37°C孵育30分钟至数小时。

菌株特异性：不同细菌对酶的敏感性不同，需要优化条件。

成本较高。

2.  化学裂解法

原理：使用强表面活性剂和变性剂同时破坏细胞壁和细胞膜。

常用试剂：

SDS：强效离子表面活性剂，是裂解G-菌的主力。

碱裂解法：SDS + NaOH。是提取质粒DNA的经典方法，能高效裂解G-菌并使染色体DNA变性，而共价闭合的质粒DNA仍保持天然状态。

优点：

快速高效。

成本低。

缺点：

剧烈：容易导致基因组DNA断裂，不适合获取完整的大片段DNA。

抑制剂问题：残留的SDS是强力的PCR抑制剂。

3.  机械裂解法（最剧烈、最通用）

原理：通过物理力量研磨或剪切破碎细胞。

常用方法：

珠磨法（Bead Beating）：样本与微小玻璃/陶瓷珠在高速振荡器中共振，珠子碰撞粉碎细胞。这是裂解G+菌（如葡萄球菌、芽孢杆菌）和分枝杆菌（如结核杆菌）的最有效方法之一。

超声破碎（Sonication）：利用超声波探头产生的高频声波在液体中形成空化效应，产生剪切力来破碎细胞。常用于染色体DNA的片段化（如ChIP-seq实验前处理）。

高压均质（French Press）：使细胞悬液通过极窄的缝隙，利用高压和剪切力使其破碎。

优点：

通用性强：几乎可以裂解所有类型的细菌，尤其擅长处理顽固的G+菌、真菌和孢子。

高效彻底。

缺点：

产热：高速研磨或超声会产生大量热量，在冰上操作以防核酸降解。

核酸片段化：会不可避免地打断DNA/RNA，不适合需要完整核酸的应用。

设备需求：需要专用仪器。

4.  反复冻融法

原理：通过冰晶形成刺破细胞膜。

优点：简单。

缺点：对绝大多数细菌效果极差，因为无法破坏坚韧的细胞壁。通常只作为辅助手段。

细菌裂解策略总结表：

 

四、 综合选择指南

选择裂解方法时，必须考虑以下两个核心问题：

1.  样本类型是什么？

病毒/有包膜病原体：优先选择化学裂解法。

革兰氏阴性菌：化学裂解法或酶裂解法通常有效。

革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌：必须使用机械裂解法（如珠磨），或强效的酶法+化学法联合策略。

2.  下游应用是什么？

qPCR（求效率）：化学裂解法（需确保纯化干净）或加热法。

克隆、测序（求完整）：酶裂解法。

蛋白研究（求活性）：温和的酶裂解或温和的去污剂（如NP-40）。

宏基因组学（求全面）：机械裂解法（珠磨），以确保破壁效率一致，无物种偏好性。

最终，对于要求严格的实验，联合使用多种方法（如先酶解再化学裂解）往往是获得最佳效果的关键。

 

来源：Internet

关键词： 病毒 细菌 样本 裂解方式