GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)简介

GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)偶联修饰是核酸药物递送系统中最常用的递送载体，其中GalNAc递送系统通常是由三触GalNAc靶头（如图1）或着单触GalNAc靶头、和连接臂或连接子（Linker）还有就是siRNA分子所构成的缀合物。这种结构的分子依赖肝细胞表面的唾液酸糖蛋白受体和GalNAc靶头配体定向结合提升了siRNA的递送效率，安全性明显提升，使得GalNAc-siRNA偶联修饰技术在治疗肝脏相关疾病小核酸药物中广泛应用

 

图1-三触GalNAc载体

 

GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)的应用以及发展前景

GalNAc修饰的药物在当前主要有GalNAc-反义核酸(ASO) 与GalNAc-小干扰核酸（siRNA），由于治疗上有效的反义核酸（ASO）已经是核苷单体分子经过大量结构修饰的在人体内不易被核酸内切酶等物质降解失效，因此递送载体对于反义核酸（ASO）并不是必须的。临床上对于小干扰核酸（siRNA）递送存在若干障碍，构成其序列的核苷单体普遍属于2'-甲氧基修饰2'-氟修饰，包括血管内降解、组织外显性和特异性、细胞内运输和细胞外基质等因素导致体内稳定性较差，未修饰的核酸在循环中的半衰期较短，因为容易血管内降解和被肾脏快速清除，载体递送技术可以完美解决这些问题，表1是近年来利用GalNac递送技术上市的小核酸药物。

 

表1. GalNac技术上市的药物

 

 

 

GalNAc（N－乙酰半乳糖胺修饰偶联技术合成缀合物）在肝脏靶向领域带来重大突破作为小核酸药物发展过程中的理想递送载体，能够解决小核酸药在进入人体后的三个主要问题：靶向性差、脱靶效应严重、稳定性差。GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）作为小核酸药物的载体，其纯度高低对于药物的有效性和安全性有重要影响，以下表2是GalNac纯度以及影响：

 

表2. GalNac纯度以及影响因素

GalNAc纯度	递送效率或载量	药物稳定性与生产工艺控制	毒性	药代动力学研究	临床有效性研究
高纯度 HPLC≥98%	• 精准递送至肝细胞，结合ASGPR受体 • 显著提升肝靶向性 • 载量高，吸收分布增强 • 疗效显著提升	1) 降低降解风险 2) 维持稳定性 3) 延长半衰期	• 提高安全性 • 降低免疫反应 • 减少分子毒性	• 优化ADME特性 • 显著提高生物利用度	• 增强靶组织药物浓度 • 显著提升治疗效果
低纯度 HPLC≤90%	• 杂质干扰ASGPR结合 • 靶向效率降低 • 肝细胞富集减少 • 吸收和疗效下降	1) 杂质加速降解 2) 稳定性受影响 3) 工艺控制难度增加	• 可能引发免疫反应 • 增加炎症/过敏风险 • 安全性降低	• 杂质干扰ADME过程 • 体内行为不可预测	• 靶向性下降 • 治疗效果减弱

 

小核酸载体GalNAc的纯度是其研发和生产中的核心指标之一。通过严格的合成工艺、先进的纯化技术以及全面的质量控制，可以确保其纯度达到临床应用的要求，GalNAc的纯度直接影响小核酸药物的靶向性、稳定性、免疫原性和药代动力学，进而影响疗效和安全性。因此笔者描述了一些实验室工艺研究以及中试放大过程中常用的纯化GalNAc （N－乙酰半乳糖胺载体）的方法，此法均为实验室实际操作过程中的经验总结与笔者个人见解的归纳

 

GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)的纯化

1.两相洗涤萃取

两相洗涤，产物的粗品使用二氯甲烷，或乙酸乙酯全部溶清，加入碳酸氢钠水溶液，或纯水，或者水和DMF混合溶剂，以及食盐水等进行洗涤后再次分液，分出有机相合并后旋干即可获得产品，此方法一般可以将极性较大的杂质留在水相。

2.硅胶柱层析

柱层析是将产物的粗品样用乙酸乙酯溶清，湿法或者干法上样，硅胶装柱子，其中硅胶填料可以选择多种市售硅胶填料，比如普通100目-200目硅胶，球形硅胶填料等等，洗脱剂既可以选择乙酸乙酯和正己烷混合溶剂冲柱子，梯度洗脱出产品，将杂质梯度分离后收集纯品，也可以选用二氯甲烷甲醇等常用溶剂梯度洗脱，最后旋干产品获得目标产物。此法是有机合成最常用的方法可快速获得纯度较好的目标产物（注意洗脱剂和点板检测产物的展开剂会根据产品不同适当而改变）。

3.制备型色谱以及色谱柱

制备液相色谱法，可以选用色谱柱Flash C18-M column ，或者其他型号色谱柱，此法为反相色谱柱，制备液相纯化成本较高，洗脱剂一般选用乙腈和水，甲醇或乙醇与水，或者乙腈和碳酸氢铵等盐的水溶液体系洗脱，先梯度洗脱分离出分子结构极性较大的杂质，再收集纯品，然后旋蒸除去溶剂，进行冻干或者再进行萃取后才能获得目标产物。

4.重结晶

单一溶剂重结晶获得目标产物，即将粗品通过溶剂如乙酸乙酯，甲醇，乙腈，四氢呋喃等加热全部溶清，再进行降温，或着浓缩挥发溶剂等方式让产物从饱和溶液体系中析出，一般情况析出的固体可以过滤，或者高速离心获得固体，如果单一溶剂对大分子量的产物溶解性不好，也可选用混合溶剂进行重结晶，比如加入DMF和乙酸乙酯混合溶剂等，再进行浓缩或降温即可析出部分纯度较高的固体产物。

5.混合溶剂析晶法或低温冷冻析晶法

混合溶剂反向滴加析晶获得固体产物，将粗品溶于乙酸乙酯，四氢呋喃，二氯甲烷中，溶清后加入正己烷，甲基叔丁基醚，正庚烷，或者石油醚等溶剂，析出浑浊固体即可继续搅拌过滤获得理想的产物，如果析出油状物质即可静置一段时间再倒出上层澄清液保留底部油状物质即可获得产物，此种油析过程需要多重复几次才有纯化效果。

6.打浆

如果样品溶解性不好，可以考虑选用单一溶剂如乙酸乙酯，二氯甲烷，四氢呋喃等实验室常用溶剂进行打浆纯化，但需要注意固体浆料分散的状态和溶剂的用量多少，如果固体浆料有大块或者分散状态较差，需要改变搅拌方法或者可以考虑混合溶剂打浆，或者先粉碎物料后再进行打浆操作，会获得比较理想的效果。

未来伴随技术持续进步，会有更多仪器和实验方法伴随时代发展而出现，如近年来越发成熟的流体化学技术，相信这些小核酸药物的载体合成方法也会越发成熟多样，未来有更多的方式进行GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）的合成以及纯化这也必将会造福社会，为患者带来更多治愈疾病的选择和机会，为饱受疾病挣扎的患者带来希望和美好的生活。

 

参考文献

1）Jayaprakash K. Nair,† Jennifer L. S. Willoughby,† Amy Chan,† Klaus Charisse,† Kallanthottathil G. Rajeev,*and Muthiah Manoharan* et al. dx.doi.org/10.1021/ja505986a | J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958−16961.

2）Jayesh A. Kulkarni , Dominik Witzigmann , Sarah B. Thomson , Sam Chen，Blair R. Leavitt，Pieter R. Cullis and Roy van der Meel  Nature Nanotechnology, 2021,16(841):630-643.

3）撰文：幻目，药度数据2024-11-05《浅析：核酸药物非病毒载体研究进展》

4）纳拉亚南奈尔• K •贾亚普拉卡什，亚历山大• V •克林，帕查穆图•坎德萨米，拉杰夫• G •卡兰托塔缇尔，莫提亚•马诺哈兰《碳水化合物共轭物及其制备改进工艺》专利公布号 CN 104717982 A

5）李冲古威李倩尹科马海萍胡天楠《LPA抑制剂及其用途》专利授权号CN 116801886 B

 

来源：药事纵横

关键词： N-乙酰半乳糖胺 纯化