摘 要： 建立谷芽饮片标准汤剂超高效液相特征图谱方法，并测定其中7种成分的含量。以Inertsil ODS-3柱（150 mm×2.1 mm，2.0 μm）为色谱柱，以甲醇-水（用0.01%磷酸溶液调节pH值至4.5）为流动相进行梯度洗脱，柱温为30 ℃，流量为0.2 mL/min，检测波长为260 nm。谷芽饮片标准汤剂特征图谱共确定了13个共有峰，确认了7个共有峰成分，其中峰1为尿嘧啶、峰3为次黄嘌呤、峰5为尿苷、峰6为腺嘌呤、峰8为鸟苷、峰12为色氨酸、峰13为腺苷。借助中药色谱指纹图谱相似度系统评价相似度，15批样品相似度在0.97以上。7种成分在各自质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.04~1.04 μg/mL，定量限为0.13~3.47 μg/mL。样品加标平均回收率为98.65%～100.13%，测定结果的相对标准偏差为0.35%～1.46%（n=9）。该方法可为谷芽饮片标准汤剂的质量控制提供参考。

 

关键词： 谷芽； 特征图谱； 高效液相色谱法； 标准汤剂； 含量测定

 

粟广泛分布于亚洲、美洲及非洲等地，我国是粟最大的栽种地［1］。粟含有丰富的营养成分如膳食纤维、淀粉、维生素及氨基酸等［2-3］，具有抗氧化、降血压、降血糖及抗炎等作用［4-6］。谷芽是粟的成熟果实经发芽干燥的炮制加工品，主要功效为消食和中、健脾开胃［7］。目前，关于谷芽的相关成分研究较少，主要集中于γ-氨基丁酸和其他物质［8-10］。

 

中药标准汤剂是在中医理论指导下，参照实际应用基础，通过现代方法对中药进行提取制备而成的［11］。通过对标准汤剂进行研究分析，有利于把控成品质量，可为后续药品制备打下基础。谷芽作为《中华人民共和国药典》2020年版一部收录药材，药典中并无规定特征图谱项及含量测定项。相关中药制品中，谷芽配方颗粒标准中有规定尿苷及腺苷的含量。核苷类是生物细胞维持生命活动必不可少的物质之一，其具有抗癌、抗病毒、抗氧化等作用［12-14］，有较好的水溶性。中药经水煎煮入药，核苷类应为其不可忽视的研究成分，从该角度出发，笔者开发了谷芽特征图谱并测定了其中7种核苷类及氨基酸类的含量，通过对谷芽标准汤剂的考察，达到后续相关制剂质量控制的目的。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Thermo Vanquish Flex UHPLC系统，配有四元溶剂管理器（VF-P20-A）、自动进样器（VF-A10-A-02）、色谱柱温箱（VH-C10-A-02）、DAD检测器（VF-D40-A），赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

电子天平：（1）ME365型，感量为0.001 mg，德国赛多利斯仪器公司；（2）XSR304型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集团。

煎药器：深圳一枚王有限公司。

冷冻干燥机：CTFD-18S型，青岛永合创信电子科技有限公司。

超纯水过滤系统：ULPHW-IV型，四川优普超纯科技有限公司。

尿嘧啶、尿苷对照品：质量分数均为99.6%，批号分别为100469-201302、110887-202305，中国食品药品检定研究院。

次黄嘌呤、腺苷对照品：质量分数均为99.4%，批号分别为140661-202005、110879-202204，中国食品药品检定研究院。

腺嘌呤、色氨酸对照品：质量分数均为100.0%，批号分别为110886-202404、140686-202205，中国食品药品检定研究院。

鸟苷对照品：质量分数为88.6%，批号为111977-202202，中国食品药品检定研究院。

甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

磷酸：分析纯，广州化学试剂厂。

实验用水为自制纯化水。

谷芽饮片样品：共15批（编号为Y1～Y15），经安徽中医药大学杨青山教授鉴定为禾本科植物粟的成熟果实经发芽干燥的炮制加工品，即为谷芽。15批谷芽药材产地信息见表1。

表1   15批谷芽产地来源信息

Tab. 1   Source information of 15 batches of millet sprouts

 

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Inertsil ODS-3柱[150 mm×2.1 mm，2.0 μm，岛津企业管理（中国）有限公司]；柱温：30 ℃；流动相：A相为甲醇，B相为水（用0.01%磷酸溶液调节pH值至4.5）；进样体积：2 μL；检测波长：260 nm；流量：0.2 mL/min；梯度洗脱程序见表2。

 

表2   梯度淋洗程序

Tab. 2   Gradient washing program

注：1）水需用0.01%磷酸溶液调节pH值至4.5。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液制备

谷芽标准汤剂冻干粉溶液：取谷芽饮片样品200 g，遵循临床汤剂煎煮方法，加水煎煮两次，合并两次煎液，煎液于65 ℃下减压浓缩至相对密度为1.04～1.10 g/mL[（65±5） ℃]流膏，冷冻干燥，制成谷芽标准汤剂冻干粉（编号为G1～G15）。取谷芽标准汤剂冻干粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20%（体积分数，下同）甲醇25 mL，超声（功率为250 W，频率40 kHz） 30 min，放冷，补足质量，取续滤液，即得。

混合对照品溶液：精密称取尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品适量，加20%甲醇溶液，制成质量浓度分别为69.7、71.6、74.7、114.5、73.3、61.1、71.8 μg/mL。

空白样品溶液：取20%甲醇溶液适量，即得。

1.3.2 实验方法

分别取15批谷芽标准汤剂冻干粉溶液、混合对照品溶液、空白样品溶液，在1.2仪器工作条件下测定。将15批样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，对所得谷芽标准汤剂色谱图进行分析。根据混合对照品的保留时间及色谱峰面积，按照外标法测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、色氨酸和腺苷的含量。

 

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

液相色谱采集时选择3D全波长扫描，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、色氨酸、腺苷分别在259、249、261、260、253、218、260 nm有最大吸收。分别在220、260、300 nm处观察色谱图。当在220 nm处基线波动较大，各峰响应值均不高；当在300 nm处仅观察到少数色谱峰；当在260 nm处多数成分有最大吸收，同时色氨酸色谱峰响应值也适中，因此选择谷芽标准汤剂检测波长为260 nm。

2.1.2 流动相的选择

结合现有文献［15-17］，对谷芽标准汤剂色谱梯度条件进行考察时发现，核苷类成分在高水相下更易洗脱，但是色谱峰的出峰顺序及分离度易受洗脱溶剂酸性影响。分别考察了0.1%甲酸、0.1%磷酸、不同浓度磷酸二氢钾水溶液、不同pH的纯水流动相对测定结果的影响。结果发现在pH值为4.50的纯水相下，谷芽标准汤剂各峰分离效果较好，基线平稳。考虑高水相对色谱柱的损害，固定使用高耐水柱Inertsil ODS-3进行检测，以提高该方法的耐用性和重复性。

2.1.3 样品溶液制备方法考察

目标成分主要为核苷类及氨基酸类物质，水溶性较好。采用水提取虽然各色谱峰响应良好、峰形对称、基线平稳，但是考虑到为谷芽提取物，纯水提取样品霉变较快，可能污染仪器并影响结果，因此考虑采用不同比例有机相提取。分别考察了10%甲醇、20%甲醇、50%甲醇、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇对谷芽标准汤剂冻干粉提取的影响。当采用乙醇作为有机相提取时，尿嘧啶色谱峰受到干扰。当采用不同比例甲醇提取时，发现提取溶剂有机相比例达到50%以上时，色谱峰会变形。当采用20%甲醇提取时，色谱峰形良好，杂质较少，因此选择20%甲醇作为提取溶剂。

对样品制备的提取方式进行了考察，比较了超声提取与加热回流提取，加热回流提取时，3#峰次黄嘌呤受到杂质干扰，因此选择超声提取的方式。分别考察了超声15、30、45 min对谷芽标准汤剂特征图谱影响，不同超声时长对应的总特征峰面积之和分别为22.569 4、22.549 8、22.340 7，超声30 min后，各组分的溶出已经趋于稳定，因此超声时长设定为30 min。

2.2 谷芽标准汤剂特征图谱研究

2.2.1 UPLC特征图谱的建立及方法专属性

精密吸取1.3.1中3种溶液各2 μL，按照1.2仪器工作条件进样，结果如图1所示。从图1中可以看出，样品溶液与混合对照品溶液色谱在相同保留时间处呈对应色谱峰，各色谱峰理论塔板数均大于4 000，阴性溶液色谱显示无干扰，表明方法专属性较好。

 

1—尿嘧啶；3—次黄嘌呤； 5—尿苷； 6—腺嘌呤；8—鸟苷；12—色氨酸； 13—腺苷2、4、7、9、10、11—未确认峰

图1　空白溶液、混合对照品溶液、样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of blank solution， mixed reference solution and sample solution

 

2.2.2 共有峰的指认及相对保留时间确定采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对所得谷芽标准汤剂的色谱图进行分析，15批谷芽标准汤剂共有13个共有峰。UPLC叠加特征图谱如图2所示，生成的共有模式如图3所示。根据对照品指认，确定1#峰为尿嘧啶、3#峰为次黄嘌呤、5#峰为尿苷、6#峰为腺嘌呤、8#峰为鸟苷、12#峰为色氨酸、13#峰为腺苷。根据各峰响应值、保留时间等影响，确定以6#峰腺嘌呤为S峰，分别计算其他峰与S峰的相对保留时间，规定值分别为0.30（峰1）、0.41（峰2）、0.53（峰3）、0.64（峰4）、0.73（峰5）、1.55（峰7）、1.62（峰8）、1.72（峰9）、1.75（峰10）、1.79（峰11）、1.84（峰12）、1.96（峰13）。

 

图2   15批谷芽标准汤剂特征图谱

Fig. 2   UPLC characteristic chromatograms of 15 batches of Guya Standard decoctions

G1~G15—15批谷芽标准汤剂冻干粉

 

  1—尿嘧啶；3—次黄嘌呤； 5—尿苷； 6—腺嘌呤；8—鸟苷；12—色氨酸； 13—腺苷2、4、7、9、10、11—未确认峰

图3　谷芽标准汤剂特征图谱共有模式图

Fig. 3   UPLC specific chromatogram of Guya Standard decoctions

2.2.3 特征图谱精密度试验

精密称定同一批次谷芽标准汤剂冻干粉6份，按1.3.1方法制备样品溶液，按照1.2仪器工作条件进样测定，特征图谱精密度试验结果见表3。由表3可知，以腺嘌呤（6#峰）为参照峰，其余各色谱峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）小于0.30%，相对峰面积的RSD小于2.00%，表明该法精密性良好。

 

表3   特征图谱精密度试验结果

Tab. 3   Test results of UPLC specific chromatograms of precision

 

2.2.4 特征图谱稳定性试验取1.3.1中谷芽标准汤剂冻干粉（G1）溶液，于0、2、4、8、12、24 h在1.2仪器工作条件下进样分析，特征图谱稳定性试验结果见表4。

 

表4   特征图谱稳定性试验结果

Tab. 4   Test results of UPLC specific chromatograms of stability

 

由表4可知，以腺嘌呤为参照峰，其余各色谱峰相对保留时间的RSD小于0.30%，相对峰面积的RSD小于3.00%，表明谷芽标准汤剂冻干粉溶液在24 h内稳定。

2.2.5 特征图谱相似度计算结果

以对照特征图谱为评价，根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，15批谷芽标准汤剂相似度依次为0.975、0.986、0.986、0.977、0.986、0.972、0.982、0.982、0.979、0.974、0.972、0.979、0.975、0.971、0.975，均大于0.97，表明多批谷芽标准汤剂质量较为稳定，成分差异较小，该方法可靠、稳定。

2.3 指标成分含量测定

2.3.1 线性方程和检出限、定量限

精密吸取混合对照品溶液适量，置于容量瓶中，稀释成6个质量浓度的系列混合标准工作溶液。在1.2仪器工作条件下条件测定，以各成分的质量浓度（x）为横坐标，以对应色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用信噪比法测定各化合物的检出限与定量限，逐级稀释混合对照品溶液并进行检测，当信噪比为3时，对应的溶液浓度为该化合物的检出限；当信噪比为10时，对应的溶液浓度为该化合物的定量限。各成分的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表5。由表5可知，7种成分在各自质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.04~1.04 μg/mL，定量限为0.13~3.47 μg/mL，表明该方法灵敏度较高，适于定量。

 

表5   7种成分的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 5   Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of seven components

 

2.3.2 稳定性试验

取谷芽标准汤剂冻干粉溶液，在1.2仪器工作条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，试验结果见表6。由表6可知，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、色氨酸、腺苷峰面积的RSD值分别为0.68%、0.76%、0.42%、1.76%、1.77%、1.43%、0.15%，表明谷芽标准汤剂冻干粉溶液在24 h内稳定。

 

表6   稳定性试验结果

Tab. 6   Test results of stability

 

2.3.3 样品加标回收试验

取同一批次谷芽标准汤剂冻干粉9份，每份约0.25 g，精密称定，按对照品量与样品实际目标物质含量分别为0.8∶1、1∶1、1.2∶1的比例精密加入混合对照品溶液，每一比例平行3份，在1.2仪器工作条件下进样，分别测定7个目标成分的含量，计算加样回收率，试验结果见表7。由表7可知，样品加标平均回收率为98.65%～100.13%，测定结果的相对标准偏差为0.35%～1.46%，表明该方法具有较高的准确度和良好的精密度。

 

表7   样品加标回收试验结果

Tab. 7   Test results of sample spike recovery

 

3 结语

建立了谷芽标准汤剂特征图谱方法，通过中药色谱指纹图谱相似度评价，确定了谷芽标准汤剂特征图谱中13个特征峰。通过对照品指认，确认了其中7个特征峰，并对这7种核苷类及氨基酸类进行了含量测定。该方法准确度高、稳定性好，分析速度快，有利于谷芽标准汤剂质量控制，为进一步提升标准提供依据。

 

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来源：化学分析计量

关键词： 谷芽 高效液相色谱法 特征图谱