摘 要： 建立了一种高效液相色谱法，用于食品中4种嘌呤含量的快速、稳定检测。于90 ℃水浴中，采用高氯酸溶液水解样品30 min，调节水解液pH值至2.20，然后选用C18色谱柱，以0.7 mL/min流量等度洗脱分离，并在254 nm波长下测定腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤含量。4种嘌呤的质量浓度在0.1～20 μg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999。4种嘌呤加标平均回收率为97.8%~100.6%， 测定结果的相对标准偏差均低于2.0 %（n=7）。实际样品检测发现动物性食品中嘌呤含量普遍高于植物性食品，尤其是海鲜和动物内脏，而植物性食品中豆类及其制品含量最高。该方法可为检测技术的发展和应用提供坚实的科学依据和技术支持。

 

关键词： 高效液相色谱法； 嘌呤； 样品预处理； 食品分析

 

嘌呤是一种广泛存在于食物中的生物碱，分子结构由一个嘧啶环和一个咪唑环稠合而成，常见的种类包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤及其衍生物等，是人体新陈代谢的关键产物，参与构成遗传物质和能量物质。然而，长期摄入高嘌呤食物，加上生活不规律，可能导致尿酸盐沉积，引发肾关节炎、肾脏疾病、结石和痛风[1-2]。正常人体血浆尿酸含量为200～410 μmol/L，男性偏高于女性，当超过 420 μmol/L（男性）、357 μmol/L（女性）时被认为是高尿酸血症，也就是痛风的无症状形式[3]。嘌呤主要通过体内代谢、核酸分解和食物获取，其中食物是主要的外源途径。嘌呤在食物中以游离态和化合态存在，化合态嘌呤主要以嘌呤碱基的形式存在[4]。目前常用的食物中嘌呤检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法以及离子对交换法等[1]，其中最具普适性的是高效液相色谱法中的反相色谱法，该方法简单、快速、灵敏度高，能实现准确的检测。为了进一步优化嘌呤的检测过程，笔者对食物样品处理步骤进行了改进，避免了传统方法中常见的沉淀、萃取和浓缩等复杂步骤，简化了实验流程，减少了样品损失和误差，从而提高了检测的准确性。此外，分别对色谱柱、流动相、流量等关键参数进行了细致的优化，使得嘌呤的检测结果更为准确和灵敏。通过对多种食物样品的检测，验证了该方法在实际应用中的有效性和可行性。该方法旨在通过优化样品前处理步骤和液相色谱检测条件，提高嘌呤检测的准确性和效率，为该检测技术的发展和应用提供坚实的科学依据和技术支持。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，配紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司。

pH计：FE28型，梅特勒托利多科技（中国）有限公司。

电子天平：(1) Quintix124-1CN型，感量为0.1 mg；(2) Quintix35-1CN型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多科技（中国）有限公司。

恒温数显水浴锅：HH-4型，温控范围为室温～100 ℃，力辰科学仪器（湖南）有限公司。

腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤标准物质：纯度（质量分数）大于99.7%，标准物质编号分别为78472-100 mg，75526-100 mg，75762-1 g，75793-10 mg，北京坛墨质检科技有限公司。

甲醇：色谱纯，西陇科学股份有限公司。

四丁基氢氧化铵：分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

磷酸二氢钾、高氯酸、氢氧化钾：均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

食品样品：市售，其中水产品类包括油贝、虾肉、虾肉、沙丁鱼、罗非鱼；畜禽肉类包括猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉；内脏类包括鸡心、鸡肾、猪肝、猪肚、鸭心；蔬菜类包括白菜、油麦菜、豆芽、韭菜、茄子、西红柿、马铃薯；菌菇类包括金针菇、海鲜菇、鲜香菇；调味品类包括鸡精、蚝油、酱油、牛肉汤；浓汤宝类包括猪骨汤、老母鸡汤；豆类：红豆、黄豆、绿豆；干制品类包括虾米干、云耳、紫菜、腐竹；酒类包括啤酒、RIO、真露。每种样品5份共计205份，采购后于4 °C下避光保存，备用。

1.2 溶液配制

混合标准储备溶液：分别准确称取10.0 mg腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤标准物质，用5 g/L的氢氧化钾溶液溶解并定容于20 mL容量瓶中，得到质量浓度均为500 μg/mL的混合标准储备溶液。

混合标准中间溶液：准确移取混合标准储备溶液 2.00 mL于20 mL容量瓶中，用5 g/L 氢氧化钾溶液定容，得到 50.0 μg/mL 的混合标准中间溶液。

系列混合标准工作溶液：移取适量50.0 μg/mL混合标准中间溶液，用5 g/L 氢氧化钾溶液配制成4种嘌呤质量浓度均分别为0、0.10、0.50、1.0、5.0、10、20 μg/mL，调节pH值为2.20。

流动相：准确称取磷酸二氢钾0.952 0 g，加水约800 mL溶解，依次加入40%四丁基氢氧化铵3 mL和甲醇50 mL，用磷酸调节pH 值至3.00，加水定容至1 000 mL。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：Aglient XDB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：26 ℃；流动相：7 mmol磷酸二氢钾-0.3%四丁基氢氧化铵- 5%甲醇，流量为0.7 mL/min；pH 值：3.00；洗脱方式：等度洗脱；洗脱时长：15 min；进样体积：10 μL；检测波长：254 nm。

1.4 实验步骤

1.4.1 样品处理取固体样品约1 g或液体样品约2 g，置于50 mL离心管中，加10%高氯酸溶液10 mL，于90 ℃水浴30 min，取出，冷却至室温，用氢氧化钾溶液调节pH值至2.20，转入50 mL容量瓶准确定容，取1 mL过0.22 μm的微孔滤膜，作为样品溶液。与样品等质量的5 g/L 氢氧化钾溶液为空白样品溶液。1.4.2 定量方法取嘌呤系列混合标准工作溶液、样品溶液、空白样品溶液，按照1.3仪器工作条件测定，以色谱峰面积外标法计算4种嘌呤的含量。

 

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱

色谱柱采用Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美国安捷伦科技有限公司)，其填料采用3种不同类型的多孔硅胶微球，表面键合辛基硅烷化学键，降低了载碳量，双封端可以把裸露的硅羟基封闭起来。研究结果表明，该填料可以快速、准确地检测食物中嘌呤这类极性物质[5‒6]。

2.1.2 流动相pH值

VURAN等[7]研究发现液相色谱法分离碱性组分时，用磷酸盐作为流动相可有效提高分离度，而磷酸盐的pH值又直接影响缓冲盐的离子强度，适宜的pH值还可以保证生物活性，所以磷酸二氢钾可用作食物中嘌呤的洗脱检测。XDB-C18 色谱柱的硅羟基酸度系数pKa范围为2.5～4.5，容易吸引碱性化合物，色谱图易产生拖尾现象，而嘌呤属于弱碱性物质，因此pH 值的设定需考虑既保持嘌呤活性，又能将其从固定相中分离出来，且具有高的准确度。鸟嘌呤和腺嘌呤的pKb值分别为3.20和4.15，流动相pH值的改变也会对其分离效果产生显著影响[8‒9]。使用稀磷酸调节流动相 pH值分别为 2.60、2.80、3.00、3.20、3.40。当pH值分别为 2.60、2.80时，腺嘌呤有拖尾现象；当pH值分别为 3.20、3.4时，嘌呤组分分离度不够，检测准确度降低；当pH值为 3.00时，4种嘌呤组分分离效果及峰形理想。

2.1.3 流动相甲醇含量

流动相仅使用磷酸二氢钾时，4 种嘌呤色谱保留时间均较长，流动相中的盐溶液会腐蚀色谱柱填料，降低其使用寿命，加入甲醇既缩短了检测时间，还能很好地保护色谱柱。嘌呤作为一种极性化合物，在色谱分析中，通过向流动相中引入四丁基氢氧化铵这种离子对试剂，可以与C18色谱柱的固定相发生相互作用。四丁基氢氧化铵在水溶液中电离后，形成了带正电的季铵阳离子，这种结构能有效与C18色谱柱的硅烷醇基团产生较强的静电作用。这种相互作用增强了色谱柱对极性嘌呤化合物的保留能力，同时四丁基氢氧化铵可以与嘌呤生成中性离子，增强与非极性相的作用，改善分离效果[6，10]。甲醇可以改变嘌呤与流动相的结合能力，破坏嘌呤物质与配体基间的亲和作用，增加流动相的洗脱强度，提高分离准确度[11]。调节流动相的甲醇体积分数分别为1%、3%、5%、7%、9%。随着甲醇含量的增加，4种嘌呤的出峰保留时间逐渐减小，分离度变小，腺嘌呤峰形拖尾增大。当甲醇含量为5% 时，4种嘌呤组分能在10 min内得到很好的分离且峰形良好。

2.1.4 流动相流量

根据前期试验结果，选择流动相为7 mmol磷酸二氢钾-0.3%四丁基氢氧化铵-5%甲醇，设定流动相流量分别为0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 mL/min。当流动相流量为0.5 mL/min时，黄嘌呤出峰保留时间超过15 min，腺嘌呤峰形呈现前沿峰；当流动相流量为0.7 mL/min时，4种嘌呤组分均能在10 min内得到有效分离，且峰形较好；当流动相流量为0.9 mL/min时，腺嘌呤峰形拖尾；当流动相流量分别为1.0、1.2 mL/min时，次黄嘌呤与腺嘌呤的分离度不够，无法完全分离。随着流动相流量的增大，出峰保留时间降低，且分离度下降，各类杂峰难以分开，检测准确度降低。此外，高流量还会使柱压升高，损坏色谱柱，缩短其使用寿命，因此采用流动相流量为0.7 mL/min。

2.1.4 色谱图

在1.3仪器工作条件下，对混合标准工作溶液（10.0 μg/mL）进行测定，色谱图见图1。从图1中可以看出，4种嘌呤在已优化的色谱条件下分离情况良好。

1—腺嘌呤；2—鸟嘌呤； 3—次黄嘌呤； 4—黄嘌呤图1　10.0 μg/mL混合标准工作溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of 10.0 μg/mL mixed standard working solutiont/min

2.2 样品处理优化

2.2.1 酸种类选择

目前食物中嘌呤的提取一般采用酸法。酸的种类选择及用量均对提取效果有显著影响[12]。分别采用高氯酸、磷酸、乙酸、甲酸、盐酸对牛肉进行提取，嘌呤测定结果见图2。从图2中可以看出，高氯酸溶液和盐酸溶液消解牛肉，均呈现较好的提取效果，由于高氯酸可以用钾盐除去，即使有少量残留也不会对后续色谱分析产生影响，因此选用高氯酸溶液作为提取溶剂对样品进行消解提取。

图2   5种酸提取样品下嘌呤含量测定结果

Fig. 2   Detection results of purine in samples extracted by 5 acids

2.2.2 高氯酸浓度

FENG等[13]采用最佳酸水解和高效液相色谱法测定预包装食品中的嘌呤，研究发现高浓度高氯酸会导致嘌呤降解，从而导致回收率降低。试验采用质量分数分别为5%、10%、15%、20%的高氯酸，分别对牛肉中嘌呤进行提取，结果见图3。从图3中可以看出，嘌呤提取含量先上升后下降，10%高氯酸提取效果最好。

图3   不同高氯酸浓度下嘌呤含量测定结果

Fig. 3   Detection results of purine content under different concentrations of perchloric acid

2.2.3 水解温度

在嘌呤的提取中，总嘌呤的提取通常采用热酸法，而冷酸提取法则常用于游离嘌呤的提取。然而，使用热的酸进行提取时，可能会导致已提取出的游离嘌呤发生分解，进而影响最终测得的总嘌呤含量[14‒15]。分别在70、75、80、85、90、95、100 ℃水浴温度下，采用10%高氯酸对牛肉中嘌呤组分提取，结果见图4。从图4中可以看出，在90 ~ 95 ℃的水解温度范围内，牛肉中嘌呤能被完全水解；在70 ~ 85 ℃的温度范围内，嘌呤水解不充分；在95 ~ 100 ℃的温度范围内，腺嘌呤和黄嘌呤的含量显著下降。综合考虑水解效率和损失程度，最终确定水解温度为90 ℃。

图4   不同水解温度下嘌呤含量测定结果

Fig. 4   Detection results of purine content at different hydrolysis temperatures

2.2.4 水解时间

检测结果的准确性受样品水解程度的影响较大，如果牛肉中核酸物质能完全被水解为游离碱基，同时保证嘌呤不被酸破坏，就能保证方法准确性。在 90 ℃水浴下，分别考察10、20、30、40、50 min下牛肉样品的水解效果见图5。从图5中可以看出，90 ℃水解30 min后嘌呤含量基本不变，核酸物质接近水解完全，因此最终选取水解时间为30 min。

图5   不同水解时间下嘌呤含量测定结果

Fig. 5   Detection results of purine under different hydrolysis times

2.3 线性范围和检出限

在1.3仪器工作条件下，对系列混合标准工作溶液进行测定，使用外标法进行定量，以4种嘌呤的质量浓度（x）为横坐标，对应的色谱峰面积（y）为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准工作曲线。分别以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)计算各目标物的检出限和定量限。4种嘌呤的线性范围、线性方程、线性相关系数、检出限及定量限见表1。由表1可知，各化合物的质量浓度在0.1～20 μg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，线性相关系数均在 0.999以上，检出限为0.007~0.014 μg/mL，定量限为0.023~0.045 μg/mL，表明该方法灵敏度良好，适于定量。

表1   线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 1   Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit, and quantification limit

 

2.4 精密度试验

混合均匀的牛肉样品均分为7份，分别按1.4.1方法处理，在1.3仪器工作条件下，测定各目标物的色谱峰面积，并计算对应的嘌呤含量，试验结果见表2。由表2可知，鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤测定结果的相对标准偏差分别为1.09%、0.877%、0.332%、1.71%，表明该方法精密度良好、重现性高，可应用于样品检测。

表2   牛肉中嘌呤精密度试验结果

Tab. 2   Precision test results of purine in beef

喷岭组分	牛肉中喷岭质量分数 (mg·g⁻¹)		RSD/%
	测定值	平均值 (mg·g⁻¹)
鸟嘴岭	0.163, 0.166, 0.168, 0.163, 0.164, 0.164, 0.165	0.165	1.09
腺嘴岭	0.173, 0.170, 0.174, 0.174, 0.173, 0.171, 0.172	0.172	0.877
次黄嘴岭	0.752, 0.759, 0.753, 0.754, 0.756, 0.755, 0.752	0.754	0.332
黄嘴岭	0.073 7, 0.071 1, 0.070 3, 0.072 2, 0.072 8, 0.073 4, 0.072 9	0.072 3	1.71

2.5 样品加标回收试验

采用所建方法对牛肉样品进行低、中、高3个浓度水平的加标回收试验，平行测定3次，试验结果见表3。由表3可知，加标样品中4种嘌呤的加标回收率为97.8%～100.6%，表明该方法准确度良好，可应用于食品中嘌呤的检测。

表3   牛肉中嘌呤加标回收试验结果

Tab. 3   Results of purine spiked recovery test in beef

喷嘴组分	本底值 (mg·g⁻¹)	加标量 (mg·g⁻¹)	测定均值 (mg·g⁻¹)	回收率 (%)	平均回收率 (%)
乌螺岭	0.164	0.08	0.242	99.2	98.9
		0.16	0.321	99.1
		0.32	0.476	98.3
腺螺岭	0.172	0.08	0.25	99.2	98.6
		0.16	0.328	98.8
		0.32	0.481	97.8
次黄螺岭	0.754	0.4	1.138	98.6	99.6
		0.8	1.553	99.9
		1.6	2.363	100.4
黄螺岭	0.074	0.04	0.112	98.2	98.9
		0.08	0.155	100.6
		0.16	0.229	97.9

 

2.6 样品测定

采用所建方法对水产等10类共41种食品进行测定，每种食品取样3次，检测结果取平均值，测定结果见表4。由表4可知，嘌呤含量（质量分数，同下）大于1.50 mg/g（高嘌呤）的食品包括水产类、内脏类、畜禽肉类、豆类、干制品类、浓汤宝和部分调味品；嘌呤含量为0.50～1.50 mg/g（中嘌呤）的食品包括部分调味品和部分蔬菜类；嘌呤含量小于0.50 mg/g（低嘌呤）的食品包括部分蔬菜类、菌类、酒类。常见食物中总嘌呤的含量由高到低排列，依次为水产类、内脏类、畜禽类、豆类、干制品、浓汤宝、调味品、蔬菜类、菌类、酒类。

表4   不同食品中嘌呤含量

Tab. 4   Purine content in different foods ( mg/g )

类别	名称	腺嘌呤 (mg/g)	鸟嘌呤 (mg/g)	次黄嘌呤 (mg/g)	黄嘌呤 (mg/g)	总嘌呤 (mg/g)
油贝	油贝	0.205 4	0.172 5	0.362 1	0.055 8	0.795 8
水产品	虾肉	0.216 2	0.313 9	0.835 5	0.001 6	1.365 6
	牡蛎	0.498 8	0.532 2	1.360 0	0.013 3	2.391 0
	沙丁鱼	0.783 0	0.891 2	2.317 0	0.000 0	3.991 2
	罗非鱼	0.221 0	0.234 1	0.438 5	0.000 0	0.893 6
畜禽肉	猪肉	0.174 1	0.126 1	0.996 8	0.000 0	1.297 0
	羊肉	0.186 6	0.201 0	0.724 7	0.063 0	1.112 3
	牛肉	0.164 5	0.172 2	0.754 4	0.074 0	1.091 1
	鸡肉	0.210 7	0.206 5	0.866 8	0.000 0	1.283 9
	鸭肉	0.205 5	0.171 2	0.622 7	0.102 8	1.102 2
内脏	鸡心	0.275 1	0.271 2	0.585 2	0.000 0	1.131 4
	鸡肾	0.383 6	0.463 5	0.372 5	0.015 7	1.235 3
	猪肝	0.760 5	1.072 5	0.265 4	0.228 9	2.327 2
	猪肚	0.426 3	0.431 2	0.501 4	0.000 0	1.358 9
	鸭心	0.280 9	0.266 6	0.559 9	0.000 0	1.107 4
蔬菜	白菜	0.024 3	0.034 6	0.085 1	0.085 1	0.144 0
	油麦菜	0.020 1	0.032 2	0.079 8	0.009 5	0.141 6
	豆芽	0.025 4	0.027 6	0.040 7	0.000 0	0.093 7
	韭菜	0.096 6	0.100 1	0.000 0	0.027 1	0.223 8
	茄子	0.008 5	0.010 9	0.153 1	0.153 1	0.172 5
	西红柿	0.239 0	0.172 2	0.000 0	0.162 3	0.573 5
	马铃薯	0.055 9	0.244 1	0.000 0	0.000 0	0.300 0
菌菇	金针菇	0.103 9	0.082 2	0.000 0	0.000 0	0.186 0
	海鲜菇	0.020 8	0.016 4	0.000 0	0.000 0	0.037 2
	鲜香菇	0.042 9	0.030 0	0.062 4	0.020 0	0.135 3
调味品	鸡精	0.000 0	0.194 5	0.784 4	0.000 0	0.978 9
	蚝油	0.019 9	0.836 6	0.940 2	0.000 0	1.796 7
	酱油	0.061 2	0.083 3	0.106 5	0.000 0	0.251 0
浓汤宝	牛肉汤	0.123 7	0.689 7	0.739 2	0.015 9	1.552 6
	猪骨汤	0.034 9	0.584 9	1.017 1	0.007 2	1.636 9
	老母鸡汤	0.048 7	0.393 1	0.639 7	0.013 7	1.081 5
豆类	红豆	0.623 9	0.904 5	0.191 2	0.090 2	1.809 8
	黄豆	0.858 6	1.144 8	0.496 9	0.084 3	2.584 6
	绿豆	0.874 2	1.119 8	1.848 6	0.198 2	4.040 8
其他	虾米干	0.064 6	0.249 3	2.723 8	0.036 4	3.037 7
	云耳	0.582 8	0.517 8	0.012 8	0.202 9	1.316 4
	荸荠	0.915 2	0.901 8	0.461 7	0.247 4	2.526 1
	腐竹	0.159 5	0.185 1	0.964 3	0.016 2	1.308 9
酒类	啤酒	0.075 1	0.103 3	0.000 0	0.117 2	0.295 6
	RIO	0.231 0	0.000 0	0.000 0	0.000 0	0.231 0
	真露	0.035 1	0.000 0	0.000 0	0.000 0	0.035 1

 

3 结论

采用高效液相色谱法测定食品中鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤4种嘌呤的含量。从食物样品处理、色谱分离条件等方面进行优化，建立了食品中4种嘌呤的最佳检测方法，并验证了方法的线性范围、精密度、准确度，所建方法具有快捷、高效、准确、精密度好等优点，可为检测技术的发展和应用提供坚实的科学依据和技术支持。采用该方法测定了10类共41种不同食品中4种嘌呤的含量，验证了该方法在实际应用中的有效性和可行性。结果发现食品中嘌呤含量差异较大，日常应合理膳食，避免长期大量摄入高嘌呤食物，减少患高尿酸血症和痛风的可能性。

 

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8 孙玉凤， 黄亚涛， 刘佳萌，等. 超高效液相色谱法检测58种大豆中的4种嘌呤化合物 ［J］.中国食品学报，2023，23（6）： 304.
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10 柳静， 赵榕， 范赛，等. 超高效液相色谱法测定中式菜肴中4种嘌呤 ［J］. 卫生研究，2023， 52（2）： 313.
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11 JIA Q， YANG Z， WANG Q， et al. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for comprehensive deter-mination of metabolites in the purine pathway of rat plasma and its application in anti-gout effects of Lycium ruthenicum Murr ［J］. Journal of Separation Science， 2023， 46（21）： e2 300 090.

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来源：Internet

关键词： 高效液相色谱法 食品 嘌呤