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高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸

嘉峪检测网 2024-11-13 20:48

导读:建立高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸的含量。

摘 要: 建立高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸的含量。采用Waters Atlantis T3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)为分离柱,以乙腈-0.1%磷酸(体积比为13∶87)为流动相,流量为1.0 mL/min,进样体积为10 μL,柱温为30 ℃,检测波长为310 nm。对香豆酸的质量浓度在0.28~13.78 mg/L范围内与色谱峰面积线性关系良好,线性相关系数为0.999 9,方法检出限为2.03 mg/kg,定量限为6.06 mg/kg。测定结果的相对标准偏差为0.62%(n=6),样品加标平均回收率为97.97%。该方法的精密度和准确度良好,可用于枸杞中对香豆酸含量的测定。

关键词: 枸杞; 对香豆酸; 高效液相色谱法

 

枸杞为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实,中华人民共和国药典(以下简称中国药典)中记载枸杞具有清热养阴、益肾、平肝等功效,可用于治疗肺痨咯血、骨蒸潮热,头晕目眩等症状[1]。枸杞在我国有着广泛的种植区域,主要产地有宁夏、新疆、甘肃、青海、内蒙古、河北等[2]。研究发现枸杞中富含多糖、黄酮、蒽醌类、萜类、氨基酸、色素、脂肪酸、挥发油、氨基酸、维生素等活性成分[3‒5],具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、保肝明目、神经保护、降血糖、抗骨质疏松、抗肿瘤等多种生物学活性[6‒11]。

作为一种药食两用的产品,枸杞深受我国人民的喜爱,在我国有着广泛的应用,如采用浸泡或者发酵等生产工艺,可将枸杞作为主要原料制备功能型保健酒[12]。含有枸杞等多种药材的保健酒,具有明显的缓解体力疲劳功能,通过动物实验确认,其缓解体力疲劳的主要成分之一为对香豆酸,通过筛查发现对香豆酸主要来源于枸杞,因此有必要对枸杞中对香豆酸含量进行测定。中国药典中枸杞的控制指标为枸杞多糖和甜菜碱,目前对枸杞的研究主要集中在枸杞多糖等成分上,关于枸杞中对香豆酸的研究则主要集中在该成分的分离、鉴定及生物活性等方面[13‒14],对其检测方法报道较少。康志欣等[15]利用超高效液相色谱-串联质谱法测定了宁夏枸杞中香豆素类和苯丙酸类9种成分的含量,其中包括对香豆酸。超高效液相色谱-串联质谱法所使用的仪器价格昂贵,对技术人员要求高,而高效液相色谱法快速、灵敏、操作简单、仪器价格也相对较低,是使用较为广泛的方法。笔者建立了高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸含量的检测方法,该方法准确度高、灵敏度高、操作简单,为枸杞药材质量控制提供了一个新的参考依据。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪:1260 Infinity型,配紫外检测器,美国安捷伦科技有限公司。

电子天平:AB135-S型,感量为0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多公司。

恒温水浴锅:DZKW-D-6型,北京市永光明医疗仪器有限公司。

纯水机:ELGA Option-Q型,法国威立雅环境集团。

甲醇、乙醇:均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司。

乙腈、磷酸:均为色谱纯,美国赛默飞世尔科技公司。

对香豆酸对照品:纯度(质量分数)为99.7%,批号为112037-202102,中国食品药品检定研究院。

枸杞药材样品:共54个批次,分别采自宁夏中宁、甘肃玉门、甘肃靖远、青海海西州4个不同的产地。

实验用水为超纯水,电阻率不低于18.2 MΩ·cm。

1.2 色谱条件

色谱柱:Waters Atlantis T3柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美国沃特世科技有限公司);柱温:30 ℃;流动相:乙腈-0.1%(体积分数,下同)磷酸水溶液(体积比为13∶87);流量:1.0 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:310 nm。

1.3 溶液配制

对香豆酸对照品储备液:275.57 mg/L,精密称取对香豆酸对照品6.91 mg,置于25 mL容量瓶中,用50% (体积分数,下同)甲醇溶液溶解并定容至标线。

对香豆酸对照品溶液:27.56 mg/L,取对香豆酸对照品储备液2.5 mL于25 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容至标线。

对香豆酸系列标准工作溶液:分别精密量取对香豆酸对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL,分别置于6只10 mL容量瓶中,加入50%甲醇溶液定容至标线,摇匀,配制成对香豆酸的质量浓度分别为0.28、0.83、1.38、2.76、5.51、13.78 mg/L的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

精密称取枸杞药材粉末约0.5 g于锥形瓶中,加入70% (体积分数,下同)乙醇溶液20 mL,称定质量,加热回流30 min,取出,冷却,再称定质量,用70%乙醇溶液补足失去的质量,摇匀,用0.22 μm针头过滤器过滤,得样品溶液。

1.5 样品测定

取对香豆酸系列标准工作溶液、样品溶液,按照1.2色谱条件测定,以色谱峰面积外标法计算枸杞药材中对香豆酸的含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长的选择

用二极管阵列检测器将对香豆酸对照品储备液在210~400 nm波长范围内进行扫描,其光谱图如图1所示。由图1可以看出,对香豆酸在310 nm处有最大吸收,故设置检测波长为310 nm。

图1   对香豆酸吸收光谱图

Fig. 1   Spectrogram of p-coumaric acid

2.1.2 流动相组成的选择

对香豆酸在酸性流动相体系下能够正常出峰,分别考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙(体积分数)酸水溶液3种流动相体系下对香豆酸色谱峰的理论塔板数和对称因子,结果见表1。由表1可知,以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相体系时,对香豆酸色谱峰的理论塔板数最高,色谱峰的对称性最好,故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

表1   不同流动相体系下对香豆酸色谱峰的理论塔板数和对称因子

Tab. 1   Theoretical plate number and symmetry factor of p-coumaric coumaric acid in different mobile phase systems

 

2.1.3 流动相比例的选择

以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相,分别考察乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为20∶80、13∶87、10∶90等度洗脱时,枸杞药材样品溶液中对香豆酸的分离效果。结果表明,当乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为13∶87时,枸杞样品溶液中对香豆酸能够有效分离,且色谱峰形较好,故选择乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为13∶87。

2.1.4 色谱柱的选择

检测药材中有效成分的色谱柱大部分以十八烷基硅烷键合硅胶(C18)为填料,分别考察了Waters Atlantis T3柱、Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱、Sepax HP-C18柱(均为250 mm×4.6 mm,5 μm),对枸杞药材中对香豆酸的分离效果。结果表明,用Sepax HP C18色谱柱分析时,对香豆酸色谱峰形较差,用Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱分析时,对香豆酸的分离度较低,用Waters Atlantis T3色谱柱时,对香豆酸的色谱峰形与分离度较好,故选择Waters Atlantis T3柱。

2.2 样品提取条件优化

枸杞中的对香豆酸存在游离型、游离酯型、可溶性糖苷型、结合型、不溶性糖苷型5种类型[16‒17],提取枸杞中的对香豆酸时,一般采用一定浓度的乙醇为溶剂,该方法提取出的是游离型对香豆酸,其含量较低;其他结合态对香豆酸以酯键、糖苷键、醚键与木素、多糖等连接,形成复合结构,需要采用酸碱水解等方式提取[18],这种方式所得对香豆酸含量较高,但枸杞在日常使用过程中,一般很少会用酸碱进行提取,因此笔者仅对枸杞中游离型对香豆酸进行提取。

2.2.1 样品提取方式的选择

分别考察了超声和回流两种提取方式,发现回流提取所得枸杞中对香豆酸的含量高于超声提取,故选择回流提取方式。

2.2.2 提取溶剂的选择

分别考察不同体积分数的甲醇溶液、乙醇溶液作为提取溶剂时枸杞药材中对香豆酸的测定结果,结果见表2。由表2可知,用70%(体积分数,下同)乙醇溶液作为提取溶剂时,所得枸杞药材中对香豆酸的含量相对较高,故选择70%乙醇溶液作为提取溶剂。

表2   不同提取溶剂时对香豆酸的测定结果

Tab. 2   Determination results of p-coumaric acid using different extraction solvents

2.2.3 提取时间的选择

选择70%乙醇溶液作为提取溶剂,分别考察不同提取时间时枸杞药材中对香豆酸的测定结果,结果见表3。由表3可知,加热回流提取30 min,对香豆酸提取率相对较高,故选择提取时间为30 min。

表3   不同提取时间时对香豆酸的测定结果

Tab. 3   Determination results of p-coumaric acid at different extraction times

 

2.3 色谱图

按照1.2色谱条件,测定对香豆酸对照品溶液及样品溶液,色谱图分别如图2~图3所示。

图2   对香豆酸对照品溶液色谱图

Fig. 2   Chromatogram of coumaric acid reference solution

图3   样品溶液色谱图

Fig. 3   Chromatogram of sample solution

2.4 线性方程和检出限

在1.2色谱条件下测定对香豆酸系列标准工作溶液,结果见表4。以对香豆酸标准工作溶液的质量浓度(x)为横坐标,对应的色谱峰面积(y)为纵坐标进行线性回归,计算线性回归方程和相关系数。得到对香豆酸线性回归方程为y=76.439 6x-0.635 3,线性相关系数为0.999 9,表明对香豆酸的质量浓度在0.28~13.78 mg/L范围内线性关系良好。

表4   对香豆酸系列标准工作溶液测定结果

Tab. 4   Determination results of series standard working solutions of p-coumaric acid

 

将对香豆酸对照品溶液进行逐级稀释,以3倍信噪比所对应的目标物在样品中的质量分数作为方法检出限,以10倍信噪比所对应的目标物在样品中的质量分数作为方法定量限。得到方法检出限为2.03 mg/kg、定量限为6.06 mg/kg。

2.5 精密度试验

取同一批次枸杞粉末6份,分别按照1.4样品处理方法制备样品溶液,在1.2色谱条件下测定,计算对香豆酸的质量分数以及相对标准偏差,结果见表5。由表5可知,枸杞中对香豆酸平均含量(质量分数)为113.63 mg/kg,测定结果的相对标准偏差为0.62%。表明该方法的精密度良好。

表5   精密度试验结果

Tab. 5   Results of precision test

 

2.6 稳定性试验

取同一枸杞样品溶液,分别在制备完成后第0、2、4、8、16、24 h进样测定,结果见表6。由表6可知,对香豆酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.83%,表明制备的样品溶液在24 h内稳定性良好。

表6   稳定性试验结果

Tab. 6   Results of stability test

 

2.7 样品加标回收试验

取已知对香豆酸含量的枸杞药材粉末9份,每份约0.25 g,精密称定,置于锥形瓶中,分别加入适量对香豆酸对照品溶液,按照1.4样品处理方法制备样品溶液,在1.2色谱条件下进行测定,结果见表7。由表7可知,对香豆酸的加标平均回收率为97.97%,表明该方法准确度良好。

表7   加标回收试验结果

Tab. 7   Results of recoveries test

 

3、 结语

 

建立了高效液相色谱测定枸杞中对香豆酸含量的方法,该方法简便、准确、灵敏度高,可以作为枸杞全面质量控制和产地区别的参考方法。

 

参考文献:

 

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引用本文: 石豪,毛琼丽,严玲,等 . 高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸[J]. 化学分析计量,2024,33(9):64. (SHI Hao, MAO Qiongli, YAN Ling, et al. Determination of p-coumaric acid in Lycium barbarum by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 64.)

 

 

来源:化学分析计量

关键词: 枸杞 对香豆酸 高效液相色谱法

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