前言

 

随着经济发展，肥胖问题日益严峻，且肥胖作为一种慢性疾病，还会增加糖尿病、心血管疾病、高血压以及癌症等疾病的患病风险。GLP-1类减肥药具有独特的作用机制及良好的减重表现，近年来在全球范围内持续热销，各大公司也在加大研发投入。研究表明，GLP-1受体（GLP-1R）广泛分布于全身多个器官或组织，GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）不仅具有多重的降糖和减重机制，而且对阿尔兹海默症、非酒精性脂肪性肝炎等疾病有潜在药效[1]。本文主要介绍当前GLP-1类药物的研发方向及优化策略，并针对GLP-1类药物常见的生物分析挑战举例说明其生物分析策略。

 

GLP-1类多肽药物的技术难点与优化策略

 

天然GLP-1过短的半衰期为GLP-1类药物的研发带来了挑战，目前有许多旨在延长药物半衰期和增强药效的策略（如图1所示）[1]。同时，多肽口服给药面临胃肠道组织结构和生理功能构成的障碍，而侵入型的给药方式会导致更高的成本和更低的患者依从度，研发GLP-1类药物的口服制剂能够让患者获益[2]。此外，GLP-1类药物具有控制血糖、降低体重和积极影响心血管功能等作用，促使人们探索其确切的作用机制[2]。

 

图1. GLP-1各药物的半衰期以及延长和增强药效的策略

 

分子结构优化

 

热门减肥药司美格鲁肽和替尔泊肽均采用了脂肪酸修饰的策略，目的是为了借助脂肪酸与人血清白蛋白（HSA）结合。浓度高且稳定的HSA作为药物在循环中的储库，可以延长药物半衰期。此外，脂肪酸修饰还可以改变药物在体内的分布，或者用于开发肽类药物的口服给药途径[4]。

 

图2. 人血清白蛋白（HSA）结构图和脂肪酸结合位点（红黄标出区域）[4]

 

创新给药方式

 

司美格鲁肽片借助促渗透剂SNAC的作用，实现了口服给药方式。SNAC在胃内的作用是升高胃内局部pH值，促进药物的跨细胞转运，并且作用充分可逆（图3）[5]。

 

图3. 司美格鲁肽口服给药后在胃内的吸收示意图[5]

 

整体调节机制

 

研究表明，GLP-1RA能够作用于胰腺，促进胰岛素分泌调节血糖；作用于大脑，中枢性地抑制食欲降低体重。相对于胰岛素等降血糖药物，GLP-1RA具有整体性调节的优势，更适合肥胖型糖尿病人（图4）[6]。此外，肽药偶联GLP-1-MK-801（图1）通过GLP-1RA介导的大脑NMDA受体拮抗作用，用于肥胖治疗[3]。

 

图4. GLP-1RA整体性调节与胰岛素优势互补

 

GLP-1类多肽药物开发中的生物分析挑战

 

药代动力学研究在GLP-1类药物开发中非常关键。例如，在结构优化过程中，通过计算半衰期来筛选出长效分子；在给药方式创新中，通过计算生物利用度来确定最佳制剂处方[4]。胰岛素、葡萄糖等生物标记物水平是评价GLP-1类药物药效的重要指标[6]。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是GLP-1类药物和生物标记物的常用检测技术，其方法开发主要面临三个方面的挑战：

 

· 干扰大、灵敏度低

 

无创给药方式研究中，因为多肽难以跨越生理屏障，生物利用度差，体内药物浓度低，需要提高分析方法的灵敏度，即提高信号和降低背景。

 

· 易结合、回收率低

 

受脂肪酸侧链、脂肪酸结合位点、肽链序列、连接子和间隔子的影响，脂肪酸修饰的GLP-1衍生物与HSA的结合能力差异较大。当结合能力较强时，待测物在样品处理过程中易出现提取回收率低的问题。

 

· 需要同时检测的相关生物标记物干扰大

 

GLP-1类药物能够调节胰岛素水平，与胰岛素药物联用有增效减副的作用。因此胰岛素和类似药物的研究需求增多，要求有足够分辨能力的分析方法[11]。GLP-1类药物促进肝脏和肌肉的葡萄糖向糖原转化，UDP-Glucose是糖原的前体。葡萄糖和UDP-Glucose的特点是基质干扰大和分子极性大，需要抗干扰能力强的分析方法。

 

GLP-1类多肽药物开发中的生物分析策略

 

面对上述GLP-1类药物开发中的生物分析挑战，通过改善前处理方法、优化液相方法和使用信号高、特异性强的MRM离子对等，可以开发满足需求的生物分析方法。下面将结合具体案例介绍其生物分析策略。

 

1、提高分析方法的灵敏度

 

在减肥药物司美格鲁肽皮肤给药后生物样品的分析过程中，通过提高信号和降低背景，LLOQ可以优化到0.4 ng/mL（图5）。

 

提高信号

 

· 使用丰度高且干扰小的MRM离子对

 

由于司美格鲁肽分子量大，广谱的同位素峰分布和多电荷会降低质谱信号，MRM模式中碰撞诱导解离（CID）产生大量不同的碎片离子也会稀释质谱响应[7,8]。为了提高灵敏度，我们建议舍去特异性差、背景高的低质量区间的碎片离子，优先考察特异性强的较大碎片离子。

 

· 浓缩样品

 

样品经过前处理方法提取净化后，体积变大，待测物浓度降低，不利于检测方法的灵敏度，可以采用吹干复溶等方式浓缩样品。在此过程中需要优化复溶液成分，以得到最佳的灵敏度（表1）。

 

降低残留

 

我们可以通过换色谱柱、改变液相条件、改变洗针液等方式来降低残留。例如，司美格鲁肽在普通的反相色谱柱Column 1上残留严重，导致分析高浓度样品后有持续的残留，使低浓度样品检测不准确。通过调整流动相pH、洗脱梯度和更换色谱柱类型，降低分析物与色谱柱之间相互作用引起的残留（图6），可以提高样品检测的准确性和检测灵敏度。

 

图5. 司美格鲁肽Blank（左图） 和LLOQ （0.4 ng/mL）（右图）LC-MS/MS图谱

 

图6. 更换色谱柱使ULOQ后Blank样品中的残留比例降低

 

表1. 司美格鲁肽LC-MS/MS方法日内准确度和精密度考查

 

2、改善提取回收率

 

脂肪酸修饰GLP-1衍生物与基质蛋白结合能力较强时，优化前处理方法使待测物与基质蛋白分离，可以改善样品回收率。

 

蛋白沉淀法（PPT）

 

在PPT除蛋白之前，需要通过预处理样品使待测物从基质蛋白中游离出来，例如，向样品中加入酸、碱、缓冲液和蛋白变性剂等预处理试剂。常用的沉淀剂包括甲醇或者三氯乙酸溶液，这些沉淀剂能产生比较松散的沉淀物，有利于待测物的游离。

 

固相萃取法（SPE）

 

待测物由于分子极性或处于离子状态时会被SPE固定相竞争性地吸附，淋洗后被洗脱液洗脱，而基质中其他成分先一步被淋洗液带走，从而实现待测物与基质成分的分离（图7）。脂肪酸修饰的GLP-1衍生物与基质中蛋白结合后体积进一步增大，在SPE固定相中渗透会比较慢，因此需要优化洗脱过程[9,10]。当待测物和与蛋白结合能力较强时，需预处理，分离化合物与蛋白复合物后，再进行SPE处理，才能实质性提高回收率。对于非流体基质，需要先预处理得到均一的液体基质，再进行SPE。

 

图7. PPT和SPE前处理的脂肪酸修饰GLP-1衍生物回收率对比

 

3、GLP-1类药物相关生物标记物，LC-MS/MS分析策略

 

与GLP-1类多肽药物相关的生物标记物包括胰岛素、胰岛素类似物、葡萄糖和葡萄糖代谢物等。LC-MS/MS方法相比其他的生物检测手段具有选择性强、分辨率高、抗干扰能力强和基质适用范围广等优势。例如，胰岛素的检测有酶联免疫法和色谱法，LC-MS/MS属于色谱法，对胰岛素、类似药物和代谢物等有足够的分辨能力，与灵敏度较高的酶联免疫法互补。

 

合适的内标选择

 

· 类似物内标

 

胰岛素不同的前处理方法如PPT和SPE会产生不一样的选择性。例如，基质中一些干扰蛋白与牛胰岛素具有相似的疏水性，在前处理过程中同时被提取可能对分析产生干扰。牛胰岛素分析使用保留时间接近、但没有干扰的类似物猪胰岛素作为内标来减少基质的影响（图8）。

 

· 同位素内标

 

稳定同位素标记化合物与待测物具有几乎完全相同的分子结构、化学性质、色谱和质谱行为，作为内标使用时，可以有效地消除电离变化和基质效应对分析的影响，被公认为是葡萄糖及代谢物质谱定量分析的较佳选择。

 

合适的色谱分析方法

 

· LC-MS/MS方法的选择性

 

LC-MS/MS方法对胰岛素、类似药物和代谢物具有分辨能力的关键是特异性强的MRM离子对。首选完整分析法，跳过酶解或者碎片化，直接在完整层面建立分析方法，使母离子保留分子量差异的特异性。其次，根据待测胰岛素结构，选择具有特异性的碎片离子组成MRM离子对，能够有效地减少干扰（表2）。

 

图8. LC-MS/MS分析待测物牛胰岛素和内标猪胰岛素图谱

 

表2. 胰岛素MRM离子对

化合物	类型	MRM
牛胰岛素	待测物	956/1114
猪胰岛素	内标	964/1130

 

· 柱色谱分离

 

葡萄糖和UDP-Glucose由于极性大，在普通反相色谱上难以保留。亲水作用色谱（HILIC）采用高乙腈低水含量的流动相与极性固定相的组合，按亲水性由小到大的顺序梯度洗脱分析物，可以成功保留葡萄糖。对于二磷酸化合物UDP-Glucose，流动相中添加的离子对试剂的疏水部分与色谱柱固定相发生作用吸附在柱床上，使固定相具有一定的离子交换能力，从而增强带相反电荷的待测物的保留（图9）。这个动态平衡的过程被称为动态离子交换模式。

 

图9. LC-MS/MS分析待测物葡萄糖（左图）和UDP-Glucose（右图）

 

综上，GLP-1类药物具有多肽常见的非特异性吸附、生物基质中稳定性差等生物分析难点，更多的分析挑战来自于药物研发创新带来的残留、提取回收率和方法灵敏度问题。其相关的生物标记物的生物分析也面临着多重挑战。通过采用不同的生物分析策略，可以解决上述问题，助力GLP-1类药物的生物分析。

 

 结语 

 

随着全球肥胖水位线的高涨，减重版司美格鲁肽和替尔泊肽等GLP-1类药物获得了巨大成功，引领了GLP-1RA适应症和肥胖适应症等方向的药物研发热潮。基于液相分离、质谱检测和样品前处理的生物分析方法，具有高选择性、较高灵敏度和较宽的线性范围，广泛适用于生物样品中GLP-1类药物的定量分析。GLP-1类药物未来研发的方向有抗体结合和Fc融合GLP-1以及肽药偶联等形式。药明康德药性评价部（DMPK）配备了LC-MS/MS和LC-HRMS等分析平台，具备丰富的实战经验，可满足各种形式大小分子的GLP-1类药物的分析需求，助力医药公司开发更有前景的减肥药。

 

参考文献：

 

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[2] Lau J , Bloch P ,Lauge Schäffer,et al. Discovery of the Once-Weekly Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) Analogue Semaglutide[J].Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 58(18):7370.DOI:10.1021/acs.jmedchem.5b00726.

 

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来源：药明康德DMPK

关键词： 多肽减肥药